林蛙油功能肽及其发酵乳饮料制备方法

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本发明公开了一种林蛙油功能肽发酵乳饮料及其制备方法，属于保健食品技术领域。该发酵乳饮料的制备包括：林蛙油功能肽的制备和功能肽发酵乳饮料的制备。它的工艺配方为：林蛙油功能肽酶解液，白砂糖，柠檬酸，稳定剂(磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、单甘脂等)，山梨酸钾。本发明涉及的发酵乳饮料原料简单易得，产品酸甜可口，色香味协调愉悦，可接受性强。本发明采用酶工程技术对林蛙油进行可控水解，既改善了林蛙油的溶解性和风味特点，又使其中的蛋白质分解成低分子量的肽类物质，使其更易吸收并提高其营养功能特性。本发明涉及的林蛙油功能肽发酵乳饮料质量指标经检测完全符合产品标准，经功能试验证明其具有抗疲劳和抗缺氧作用。

1.一种林蛙油功能肽发酵乳饮料，其特征在于其制备方法如下：柠檬酸溶液、稳定剂、山梨酸钾溶液→混合调配原料乳→预处理→杀菌→冷却→发酵→冷却搅拌→混合调配→预热均质→杀菌→冷却→灌装→成品功能肽和白砂糖溶液→混合调配选用鲜牛奶作为基料，通过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌两种活性乳酸菌发酵制得发酵乳，再加入1-5倍纯净水和肽液、白砂糖和柠檬酸等配料制备功能性发酵乳饮料；此工艺中杀菌方法采用95℃，10min，冷却到43℃，采用3％-5％保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)发酵，搅拌混入配料，均质后二次杀菌(85℃，20min)罐装制得成品。 2.根据权利要求1所述的林蛙油功能肽发酵乳饮料的制备，其特征在于所涉及的林蛙油功能肽的制备方法如下：精选林蛙油→浸泡→匀浆→酶解→离心分离→上清液灭酶→脱腥脱色→过滤冷却→功能肽酶解溶液按一定料液比向精选林蛙油中加入蒸馏水，浸泡溶胀10h-15h，匀浆，按5％-20％添加生姜汁后加热煮沸2h，冷却到60℃，按0.2％-0.5％加入生物酶，酶解时间为3h-6h，85℃20分钟灭酶，3000转/分20分钟离心分离，上清液活性炭吸附(40℃，2％的活性炭处理1h)，过滤冷却，即得功能肽酶解液。 3.根据权利要求2所述的林蛙油功能肽的制备，其特征在于所述的生物酶选用姜汁蛋白酶和木瓜蛋白酶或姜汁蛋白酶和碱性蛋白酶组合。 4.根据权利要求1所述的林蛙油功能肽发酵乳饮料，其特征在于工艺配方为添加林蛙油功能肽酶解液10％-20％，白砂糖8％-15％，柠檬酸0.1％-0.5％，稳定剂(磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、单甘脂等)0.1-0.6％，山梨酸钾0.01-0.05％。 5.根据权利要求1和权利要求4所述的林蛙油功能肽发酵乳饮料，其特征在于配方中的白砂糖可以用蜂蜜、糖醇和甜蜜素等甜味剂代替。 6.根据权利要求1-5所述制备的林蛙油功能肽发酵乳饮料，其特征在于经质量指标检测完全符合产品标准，且每天食用一定剂量具有抗疲劳和耐缺氧作用。 

技术领域

本发明属于保健食品领域，特别是涉及林蛙油功能肽及其发酵乳饮料的制备方法。 

背景技术

目前，我国林蛙产品的开发主要是蛤蟆油原干品，此外还有冰糖蛤士蟆油，林蛙油口服液、林蛙油胶囊、饮料等。从目前开发的有关林蛙产品看，存在着产品种类不全、产品用途单一等缺点，因此有必要采用现代加工新技术，如现代分离纯化技术，生物酶工程技术，微胶囊包埋技术等进行林蛙产品(包括食品、保健品、药品等)的开发研究，以确保原料中有效成分生理活性不损失，高效利用。 

近年来，小肽类产品开发受到人们广泛关注，因为肽类物质是由氨基酸分子聚合成的小分子物质，比蛋白质更易被人体消化吸收和利用，而且还具有特殊功能，如抗疲劳、抗衰老、降血压、排毒养颜等功效。为提高林蛙油利用率和营养价值，本发明研究采用酶工程技术对林蛙油进行可控水解，既改善了林蛙油的溶解性和风味特点，又使其中的蛋白质分解成低分子量的肽类物质，并且随着水解程度的提高，使得具有特殊活性成分的游离雌二醇的利用也得以发挥更大功效。 

研究林蛙油生物酶解制备功能肽及发酵乳饮料，采用生姜汁蛋白酶作为生物酶之一，既改善了饮料风味，增加了林蛙油保健食品的花色品种，对提高人体免疫力、抗疲劳、抗缺氧和抗氧化等具有重要作用，从而促进林蛙产业的可持续发展。 

发明内容

1)、技术问题： 

本发明所要解决的技术问题是提供一种林蛙油功能肽发酵乳饮料的制备方法。 

2)、技术方案： 

本发明解决问题的技术方案是： 

本发明涉及一种林蛙油功能肽及其发酵乳饮料的制备方法，其特征在于该方法步骤如下： 

(1)林蛙油功能肽的制备 

精选林蛙油→浸泡→匀浆→酶解→离心分离→上清液灭酶→脱腥脱色→过滤冷却→功能肽酶解溶液 

按一定料液比向精选林蛙油中加入蒸馏水，浸泡溶胀10h-15h，匀浆，按5％-20％添加生姜汁后加热煮沸2h，冷却到60℃，按0.2％-0.5％加入生物酶，酶解时间为3h-6h，85℃20分 钟灭酶，3000转/分20分钟离心分离，上清液活性炭吸附(40℃，2％的活性炭处理1h)，过滤冷却，即得功能肽酶解液。 

姜汁的制备是将生姜去皮后洗净，加入姜重量1.5-2倍的蒸馏水，用组织捣碎机捣碎后四层纱布过滤得粗姜汁，再3000转/分20分钟离心去除颗粒，得生姜汁放于4℃冰箱内储存备用。 

(2)功能肽发酵乳饮料的制备工艺过程 

柠檬酸溶液、稳定剂、山梨酸钾溶液→混合调配 

原料乳→预处理→杀菌→冷却→发酵→冷却搅拌→混合调配→预热均质→杀菌→冷却→灌装→成品 

功能肽和白砂糖溶液→混合调配 

选用鲜牛奶作为基料，通过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌两种活性乳酸菌发酵制得发酵乳，再加入1-5倍纯净水和肽液、白砂糖和柠檬酸等配料制备功能性发酵乳饮料。此工艺中杀菌方法采用95℃，10min，冷却到43℃，采用3％-5％保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)发酵，搅拌混入配料，均质后二次杀菌(85℃，20min)罐装制得成品。 

(3)功能肽发酵乳饮料的配方组成 

功能肽发酵乳饮料的口味与稳定性受多种因素的影响。选用功能肽酶解液、白砂糖、柠檬酸三个主要影响因素的添加量进行口味试验；选用磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、单甘脂等作为稳定性试验因素，在单因素实验基础上分别进行正交设计。以感官评定作为比较指标，确定最佳配方为林蛙油功能肽酶解液10％-20％，白砂糖8％-15％，柠檬酸0.1％-0.5％，稳定剂(磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、单甘脂等)0.1-0.6％，山梨酸钾0.01-0.05％。 

(4)功能肽发酵乳饮料的质量指标 

感官指标根据饮料的组织状态、气味、口感等综合评分，10位有经验教师和研究生参加评定。理化指标和微生物指标测定根据国标。经分析功能肽发酵乳饮料色泽呈乳白色，澄清，无肉眼可见的外来杂质；口感酸甜，无异味，具有乳香味。蛋白质含量大于1.28％；总酸(以柠檬酸计)为0.23％，细菌总数20个/ml；大肠菌群数3个/100ml；致病菌未检出。 

(5)林蛙油功能肽发酵乳饮料抗缺氧、抗疲劳动物实验模型的建立与效果 

将小鼠随机分为4组，每组12只，组间体重经t检验无显著差异。对照组、低剂量、中剂量组和高剂量组喂标准小鼠饲料。试验组每10g体重每日每鼠灌胃给药0.2ml，其中低剂量、 中剂量组和高剂量组分别含林蛙油功能肽发酵乳饮料为25％，50％和100％，对照组同途径给予等量的生理盐水。饲养7天后进行试验，测定各指标。 

①常压抗缺氧实验 

将试验组和对照组于末次给予受试物30min后，将小鼠单个放入盛有7.5克碳酸钙和7.5克氢氧化钠的250ml广口瓶中，瓶口和瓶塞涂抹凡士林后盖严，使之不漏气，立即计时，以呼吸停止为指标，观察并记录小鼠存活时间。研究证明实验组与对照组相比，高剂量组缺氧存活时间提高了48％(p＜0.01)，中剂量组缺氧存活时间提高了33％(p＜0.05)；低剂量组缺氧存活时间提高不明显。表明林蛙油功能肽发酵乳饮料具有抗缺氧作用。 

②游泳试验 

末次给予受试物30min后，给小鼠负体重5％重量，将小鼠放于水深不少于30cm，水温25±1℃的游泳箱中。记录自游泳开始至头部全部沉入水中8s不能浮出水面的时间作为小鼠游泳时间。实验组与对照组相比，高剂量组游泳时间提高了64％(p＜0.01)，中剂量组游泳时间提高了38％(p＜0.05)，低剂量组游泳时间提高不明显。 

③肝糖原的测定 

末次给予受试物30min后，将小鼠放于水温30±1℃的水中游泳60min后停止，立即处死小鼠取出肝脏，精确称取200mg；加入TCA4ml，每管匀浆1min，3000r/min离心15min，取上清液转移至另一试管内。在沉淀中加入TCA4ml，匀浆1min，再次离心15min，取上清液；与第一次离心的上清液合并，充分混匀。取1ml上清液，每管加入95％的乙醇4ml，充分混匀至两种液体间不留有界面。室温放置过夜。沉淀完全后将试管于3000r/min离心15min。小心倒掉上清液并使试管放置10min，用1ml蒸馏水振荡溶解后测定。高剂量组肝糖原含量为对照组的2.75倍(p＜0.001)，中剂量组肝糖原含量为对照组的1.88倍(p＜0.01)，低剂量提高不明显。 

④血乳酸的测定 

末次给予受试物30min后，将小鼠放于水温30±1℃的水中负重4％游泳10min停止，分别从游泳前、游泳之后的小鼠眼内眦静脉丛取血。于5ml离心管中加入1％NaF溶液0.48ml，准确吸取全血20μl加入试管底部。用试管上清液冲洗微量吸管数次，再加入蛋白沉淀剂1.5ml，振荡混匀，3000r/min离心10min，取上清液测定。高中剂量组游泳后与游泳前相比，血乳酸含量与对照组相比分别减少63.5％(p＜0.01)和35.6％(p＜0.05)，并且趋于游泳前的乳酸水平，而低剂量组血乳酸含量与对照组相比变化不明显。 

从以上②③④结果可以看出，高中剂量实验组与对照组相比游泳时间显著提高；肝糖原 含量显著性提高，游泳后与游泳前相比，血乳酸含量变化较小，表明林蛙油功能肽发酵乳饮料具有延缓疲劳出现的作用。 

在本发明中所述的发酵剂选自保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵剂。 

本发明中所述的生物酶选用姜汁蛋白酶和木瓜蛋白酶或姜汁蛋白酶和碱性蛋白酶组合。 

本发明涉及的林蛙油功能肽发酵乳饮料配方中的白砂糖可以用蜂蜜、糖醇和甜蜜素等甜味剂代替。 

本发明涉及的林蛙油功能肽发酵乳饮料配方中的稳定剂主要有磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、单甘脂等。 

本发明制得的产品证明具有抗疲劳和抗缺氧作用。 

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。 

实施例1 

一种林蛙油功能肽发酵乳饮料，是按照下列配方与制备方法制得： 

(1)林蛙油功能肽的制备 

精选林蛙油→浸泡→匀浆→酶解→离心分离→上清液灭酶→脱腥脱色→过滤冷却→功能肽酶解溶液 

按料液比1∶20向精选林蛙油中加入蒸馏水，浸泡溶胀12h，匀浆，按10％添加生姜汁后加热煮沸2h，冷却到60℃，按0.4％加入木瓜蛋白酶，酶解时间为4h，85℃20分钟灭酶，3000转/分20分钟离心分离，上清液活性炭吸附(40℃，2％的活性炭处理1h)，过滤冷却，即得功能肽酶解液。 

姜汁的制备是将生姜去皮后洗净，加入姜重量2倍的蒸馏水，用组织捣碎机捣碎后四层纱布过滤得粗姜汁，再3000转/分20分钟离心去除颗粒，得生姜汁放于4℃冰箱内储存备用。 

(2)功能肽发酵乳饮料的制备工艺过程 

柠檬酸溶液、稳定剂、山梨酸钾溶液→混合调配 

原料乳→预处理→杀菌→冷却→发酵→冷却搅拌→混合调配→预热均质→杀菌→冷却→灌装→成品 

功能肽和白砂糖溶液→混合调配 

选用鲜牛奶作为基料，通过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌两种活性乳酸菌发酵制得发酵乳，再加入2倍纯净水和15％的林蛙油功能肽酶解液，8％的白砂糖，0.15％的柠檬酸，0.3％的稳定剂(磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、单甘脂等)和0.05％的山梨酸钾等配料制备功能性发酵乳饮料。此工艺中杀菌方法采用95℃，10min，冷却到43℃，采用3％保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)发酵，搅拌混入配料，均质后二次杀菌(85℃，20min)罐装制得成品。 

实施例2 

一种林蛙油功能肽发酵乳饮料，是按照下列配方与制备方法制得： 

(1)林蛙油功能肽的制备 

精选林蛙油→浸泡→匀浆→酶解→离心分离→上清液灭酶→脱腥脱色→过滤冷却→功能肽酶解溶液 

按料液比1∶20向精选林蛙油中加入蒸馏水，浸泡溶胀10h，匀浆，按10％添加生姜汁后加热煮沸2h，冷却到60℃，按0.4％加入碱性蛋白酶，酶解时间为5h，85℃20分钟灭酶，3000转/分20分钟离心分离，上清液活性炭吸附(40℃，2％的活性炭处理1h)，过滤冷却，即得功能肽酶解液。 

姜汁的制备是将生姜去皮后洗净，加入姜重量1.5倍的蒸馏水，用组织捣碎机捣碎后四层纱布过滤得粗姜汁，再3000转/分20分钟离心去除颗粒，得生姜汁放于4℃冰箱内储存备用。 

(2)功能肽发酵乳饮料的制备工艺过程 

柠檬酸溶液、稳定剂、山梨酸钾溶液→混合调配 

原料乳→预处理→杀菌→冷却→发酵→冷却搅拌→混合调配→预热均质→杀菌→冷却→灌装→成品 

功能肽和白砂糖溶液→混合调配 

选用鲜牛奶作为基料，通过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌两种活性乳酸菌发酵制得发酵乳，再加入3倍纯净水和10％的林蛙油功能肽酶解液，10％的白砂糖，0.2％的柠檬酸，0.4％的稳定剂(磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、单甘脂等)和0.03％的山梨酸钾等配料制备功能性发酵乳饮料。此工艺中杀菌方法采用95℃，10min，冷却到43℃，采用3％保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)发酵，搅拌混入配料，均质后二次杀菌(85℃，20min)罐装制得 成品。 

实施例3 

一种林蛙油功能肽发酵乳饮料，是按照下列配方与制备方法制得： 

(1)林蛙油功能肽的制备 

精选林蛙油→浸泡→匀浆→酶解→离心分离→上清液灭酶→脱腥脱色→过滤冷却→功能肽酶解溶液 

按料液比1∶20向精选林蛙油中加入蒸馏水，浸泡溶胀12h，匀浆，按15％添加生姜汁后加热煮沸2h，冷却到60℃，按0.5％加入木瓜蛋白酶，酶解时间为5h，85℃20分钟灭酶，3000转/分20分钟离心分离，上清液活性炭吸附(40℃，2％的活性炭处理1h)，过滤冷却，即得功能肽酶解液。 

姜汁的制备是将生姜去皮后洗净，加入姜重量1.5倍的蒸馏水，用组织捣碎机捣碎后四层纱布过滤得粗姜汁，再3000转/分20分钟离心去除颗粒，得生姜汁放于4℃冰箱内储存备用。 

(2)功能肽发酵乳饮料的制备工艺过程 

柠檬酸溶液、稳定剂、山梨酸钾溶液→混合调配 

原料乳→预处理→杀菌→冷却→发酵→冷却搅拌→混合调配→预热均质→杀菌→冷却→灌装→成品 

功能肽和白砂糖溶液→混合调配 

选用鲜牛奶作为基料，通过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌两种活性乳酸菌发酵制得发酵乳，再加入4倍纯净水和15％的林蛙油功能肽酶解液，15％的白砂糖，0.3％的柠檬酸，0.5％的稳定剂(磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、单甘脂等)和0.04％的山梨酸钾等配料制备功能性发酵乳饮料。此工艺中杀菌方法采用95℃，10min，冷却到43℃，采用4％保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)发酵，搅拌混入配料，均质后二次杀菌(85℃，20min)罐装制得成品。 

实施例4 

一种林蛙油功能肽发酵乳饮料，是按照下列配方与制备方法制得： 

(1)林蛙油功能肽的制备 

精选林蛙油→浸泡→匀浆→酶解→离心分离→上清液灭酶→脱腥脱色→过滤冷却→功能肽酶 解溶液 

按料液比1∶20向精选林蛙油中加入蒸馏水，浸泡溶胀13h，匀浆，按15％添加生姜汁后加热煮沸2h，冷却到60℃，按0.5％加入碱性蛋白酶，酶解时间为3h，85℃20分钟灭酶，3000转/分20分钟离心分离，上清液活性炭吸附(40℃，2％的活性炭处理1h)，过滤冷却，即得功能肽酶解液。 

姜汁的制备是将生姜去皮后洗净，加入姜重量2倍的蒸馏水，用组织捣碎机捣碎后四层纱布过滤得粗姜汁，再3000转/分20分钟离心去除颗粒，得生姜汁放于4℃冰箱内储存备用。 

(2)功能肽发酵乳饮料的制备工艺过程 

柠檬酸溶液、稳定剂、山梨酸钾溶液→混合调配 

原料乳→预处理→杀菌→冷却→发酵→冷却搅拌→混合调配→预热均质→杀菌→冷却→灌装→成品 

功能肽和白砂糖溶液→混合调配 

选用鲜牛奶作为基料，通过保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌两种活性乳酸菌发酵制得发酵乳，再加入2倍纯净水和10％的林蛙油功能肽酶解液，12％的白砂糖，0.3％的柠檬酸，0.5％的稳定剂(磷酸二氢钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、单甘脂等)和0.03％的山梨酸钾等配料制备功能性发酵乳饮料。此工艺中杀菌方法采用95℃，10min，冷却到43℃，采用5％保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌(1∶1)发酵，搅拌混入配料，均质后二次杀菌(85℃，20min)罐装制得成品。 

本文标签： 制备方法饮料功能林蛙