一种脂肽纳米二氧化钛复合制剂及其制备方法和应用

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本发明公开了脂肽‑纳米二氧化钛复合制剂，其特征在于，该制剂包含如下质量百分比的组分：脂肽0.075％～0.15％、纳米二氧化钛0.2％～0.3％、Zn2+0.0069％～0.0092％、Fe2+0.005％～0.007％、Cu2+0.0052％～0.0091％和Mn2+0.005％～0.0083％，其余为水。本发明还公开了上述脂肽‑纳米二氧化钛复合制剂的制备方法及其在防治番茄青枯病和促进番茄植株生长中的应用。本发明制备的脂肽‑纳米二氧化钛复合制剂，纳米二氧化钛与脂肽的结合后能提高脂肽的稳定性，延长脂肽的作用时间，对番茄青枯病的有较好的防治效果，且能够促进番茄植株生长。

1.一种脂肽-纳米二氧化钛复合制剂，其特征在于，该制剂包含如下质量百分比的组分：脂肽0.075％～0.15％；纳米二氧化钛0.2％～0.3％；微量元素Zn0.0069％～0.0092％、Fe0.005％～0.007％、Cu0.0052％～0.0091％和Mn0.005％～0.0083％；其余为水；其中，所述脂肽的制备方法如下：(1a)活化解淀粉芽孢杆菌，获得种子液，所述解淀粉芽孢杆菌为解淀粉芽孢杆菌CGMCCNo.4160；(1b)将种子液转接到发酵培养基中，调节发酵罐内相对湿度大于80％，发酵产脂肽；(1c)发酵结束后，将发酵得到的混合物与水按照1g：10mL比例混合均匀，离心，收集上清，用盐酸调节上清液pH为1～3，静置，再离心，收集沉淀，沉淀用二氯甲烷抽提，再旋蒸去除二氯甲烷，残留物用水溶解并调pH为7.0，最后冷冻干燥得脂肽粉末；所述纳米二氧化钛的制备方法如下：(2a)硫酸钛按0.1mol/L的浓度溶于水中，加入2～3mol/L的氨水溶液，使溶液的pH为6～8，得到混合物；(2b)将混合物离心，收集沉淀，用水洗涤沉淀；(2c)将步骤(2b)得到的沉淀分散于水中，加入体积比为30％的过氧化氢水溶液，使溶液中Ti和HO的摩尔比为1：3～5，搅拌均匀，静置15～20小时，得到过氧钛酸溶胶；(2d)将过氧钛酸溶胶在60～75℃烘干形成干凝胶，将干凝胶研磨成粉末，在400～600℃条件下煅烧1～2小时，得到纳米二氧化钛粉末。 2.权利要求1所述的脂肽-纳米二氧化钛复合制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：(1)脂肽的制备：(1a)活化解淀粉芽孢杆菌，获得种子液；(1b)将种子液转接到发酵培养基中，调节发酵罐内相对湿度大于80％，发酵产脂肽；(1c)发酵结束后，将发酵得到的混合物与水按照1g：10mL比例混合均匀，离心，收集上清，用盐酸调节上清液pH为1～3，静置，再离心，收集沉淀，沉淀用二氯甲烷抽提，再旋蒸去除二氯甲烷，残留物用水溶解并调pH为7.0，最后冷冻干燥得脂肽粉末；(2)纳米二氧化钛的制备：(2a)硫酸钛按0.1mol/L的浓度溶于水中，加入2～3mol/L的氨水溶液，使溶液的pH为6～8，得到混合物；(2b)将混合物离心，收集沉淀，用水洗涤沉淀；(2c)将步骤(2b)得到的沉淀分散于水中，加入体积比为30％的过氧化氢水溶液，使溶液中Ti和HO的摩尔比为1：3～5，搅拌均匀，静置15～20小时，得到过氧钛酸溶胶；(2d)将过氧钛酸溶胶在60～75℃烘干形成干凝胶，将干凝胶研磨成粉末，在400～600℃条件下煅烧1～2小时，得到纳米二氧化钛粉末；(3)微量元素液的制备：将微量元素溶解于水中，得到微量元素水溶液；(4)脂肽-纳米二氧化钛复合制剂获得：向步骤(3)得到的微量元素水溶液中，依次加入步骤(1)得到的脂肽和步骤(2)得到的纳米二氧化钛，搅拌摇匀，在20～40℃、150～250rpm条件下，振荡10～30h，即得到脂肽-纳米二氧化钛复合制剂。 3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1b)中，所述的发酵培养基按照如下方法等比例制备得到：称取4.5～6kg黄豆粉、3～4.5kg秸秆、0.15～0.2kg淀粉和0.15～0.2kg酵母提取物，放入发酵罐中，加入1～2L无机盐溶液，调节pH为7～8，调节培养基的含水率为40％～60％，所述无机盐溶液，其配方为：1.0g/LKHPO、0.5g/LMgSO·7HO、0.5g/LKCl、2×10g/LL-苯丙氨酸、5×10g/LMnSO、0.16×10g/LCuSO、0.15×10g/LFeSO。 4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤(1b)中，发酵过程采用变温发酵，在发酵过程中保持通气量为0.1～0.5vvm、罐压为0.01～0.05Mpa，第一阶段发酵温度为25～40℃，发酵20～24h，第二阶段的发酵温度为28～40℃，发酵16～24h，且保证第二阶段发酵的温度要比第一阶段温度高0～7℃。 5.权利要求1所述的脂肽-纳米二氧化钛复合制剂在防治番茄青枯病中的应用。 6.权利要求1所述的脂肽-纳米二氧化钛复合制剂在促进番茄植株生长上的应用。

技术领域

本发明属于微生物源农药制备领域，涉及一种脂肽-纳米二氧化钛复合制剂及其制备方法和应用。

背景技术

番茄青枯病是由茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种全世界广泛分布的细菌性土传病害。发病初期，植株下部叶片的叶柄出现下垂，而后叶片渐次枯萎，同时茎部出现不定根，植株快速萎蔫并逐渐枯死。轻则减产20％～40％，严重时达60％以上甚至绝收。茄科雷尔氏菌存在较大的遗传变异，目前尚无有效的化学防治方法。常用的防治措施如抗性育种、田间清除、作物轮作、综合管理等由于青枯病病害系统的复杂性而成效甚微。

芽孢杆菌(Bacillus spp.)具有复杂的生理学性质多样性和底物多样性,能够产生高耐性芽孢和各种抑菌物质如多肽类和脂肽类及细菌素类抗生素。脂肽类表面活性剂作为一种生物表面活性剂(biosurfactant)，能够改变细胞膜通透性，具有广谱的抗真菌和抑制部分细菌的活性，研究表明，某些脂肽类物质对立枯丝核菌和青枯菌表现出很好的拮抗活性，可以利用其防治青枯病，但是其化学不稳定性，物理和酶不稳定性，限制了脂肽类表面活性剂相关产品的开发和应用。同时，较高的生产成本和较低的产量也限制了脂肽的工业化生产。

近年来，生物材料与有机膜、有机颗粒、无机粘土材料之间相互作用制备复合材料，在学术界已经引起了相当大的兴趣，特别是无机纳米亚微米级材料结构丰富新颖、热稳定性优良、表面活性可调节、价格低廉，生物材料和无机纳米材料的有效复合，能够很好维持生物大分子的结构，并且有可能会赋予生物物质新的优异特性。纳米二氧化钛具有许多优异的物理和化学特性，比如高比表面积、更多的表面原子和良好的稳定性，可用作蛋白质、农药、杀虫剂的载体，并且能够固定金属离子。纳米二氧化钛能够提供一个适合的微环境以固定酶及其他蛋白质，维持被固定的酶及蛋白质的生物活性和稳定性。有关研究表明，纳米二氧化钛对于细菌生长具有一定的抑制作用，另外，纳米二氧化钛还能够促进植物生长。

微量元素对于植物是必需的，研究表明，叶面喷施微量元素液能够对植物的生长和产量起到一些积极的作用。

发明内容

本发明需要解决的技术问题是，提供一种脂肽-纳米二氧化钛复合制剂。

本发明还要解决的技术问题是，提供上述脂肽-纳米二氧化钛复合制剂的制备方法。

本发明还要要解决的技术问题是，提供上述脂肽-纳米二氧化钛复合制剂在防治番茄青枯病中的应用。

本发明最后要解决的技术问题是，提供上述脂肽-纳米二氧化钛复合制剂在促进番茄植株生长上的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种脂肽-纳米二氧化钛复合制剂，该制剂包含如下质量百分比的组分：

脂肽 0.075％～0.15％；

纳米二氧化钛 0.2％～0.3％；

微量元素 Zn2+0.0069％～0.0092％、Fe2+0.005％～0.007％、Cu2+0.0052％～0.0091％和Mn2+0.005％～0.0083％；

其余为水。

其中，所述的脂肽，按照如下方法制备得到：

(1a)活化解淀粉芽孢杆菌，获得种子液；所有能发酵生产脂肽的解淀粉芽孢杆菌都可以用于生产本发明中的脂肽，本发明中优选利用中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏的解淀粉芽孢杆菌菌株XZ-173，保藏号为CGMCC No.4160，该菌株的具体信息已经在申请号为201010608579.1的中国专利中公开；

具体的活化解淀粉芽孢杆菌的方法如下：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌菌株在LB平板上划线，置于30℃培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30℃，170rpm的条件下培养24h，获得发酵种子液；

(1b)将种子液转接到发酵培养基中，调节发酵罐内相对湿度大于80％，发酵产脂肽；

(1c)发酵结束后，将发酵得到的混合物与水按照按照1g：10mL比例混合均匀，离心，收集上清，用盐酸调节上清液pH为1～3，静置，再离心，收集沉淀，沉淀用二氯甲烷抽提，再旋蒸去除二氯甲烷，残留物用水溶解并调pH为7.0，最后冷冻干燥得脂肽粉末。

其中，所述的纳米二氧化钛按照如下方法制备得到：

(2a)硫酸钛按0.1mol/L的浓度溶于水中，加入2～3mol/L的氨水溶液，使溶液的pH为6～8，得到混合物；

(2b)将混合物离心，收集沉淀，用水洗涤沉淀；

(2c)将步骤(2b)得到的沉淀分散于水中，加入体积比为30％的过氧化氢水溶液，使溶液中Ti4+和H2O2的摩尔比为1：3～5，搅拌均匀，静置15～20小时，得到过氧钛酸溶胶；

(2d)将过氧钛酸溶胶在60～75℃烘干形成干凝胶，将干凝胶研磨成粉末，在400～600℃条件下煅烧1～2小时，得到纳米二氧化钛粉末。

其中，所述的纳米二氧化钛粒径为10～40nm。

二氧化钛具有比表面积大、吸附能力强、稳定性好及其他纳米级材料的表面效应，表面具有许多活性中心，可以利用二氧化钛将脂肽和微量元素离子有效结合在一起，很好地维持了脂肽的结构，提高了微量元素离子的稳定性，并且更好地发挥了脂肽的生物特性。

其中，所述的微量元素为Zn2+盐、Fe2+盐、Cu2+盐和Mn2+盐中的任意一种或几种的混合物。

所述的Zn2+盐、Fe2+盐、Cu2+盐和Mn2+盐，可以是上述离子的硫酸盐、硝酸盐或盐酸盐等，优选硫酸盐。

作为优选，所述的微量元素为Zn2+盐、Fe2+盐、Cu2+盐和Mn2+盐的混合物，所述的Zn2+盐、Fe2+盐、Cu2+盐和Mn2+盐的混合物优选ZnSO4、FeSO、CuSO4和MnSO4的混合物，进一步优选ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O的含量分别0.3～0.4g/L、0.25～0.35g/L、0.2～0.35g/L和0.15～0.25g/L的混合物，最优选ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O的含量为0.35g/L，0.3g/L，0.24g/L和0.18g/L的混合物。

上述脂肽-纳米二氧化钛复合制剂的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)脂肽的制备：

(1a)活化解淀粉芽孢杆菌，获得种子液；

(1b)将种子液转接到发酵培养基中，调节发酵罐内相对湿度大于80％，发酵产脂肽；

(1c)发酵结束后，将发酵得到的混合物与水按照1g：10mL比例混合均匀，离心，收集上清，用盐酸调节上清液pH为1～3，优选调节pH为2，4℃下静置12h，再离心，收集沉淀，沉淀用二氯甲烷抽提，再旋蒸去除二氯甲烷，残留物用水溶解并调pH为7.0，最后冷冻干燥得脂肽粉末；

(2)纳米二氧化钛的制备：

(2a)硫酸钛按0.1mol/L的浓度溶于水中，加入2～3mol/L的氨水溶液，使溶液的pH为6～8，优选调节溶液的pH为7得到混合物；

(2b)将混合物离心，收集沉淀，用水洗涤沉淀；

(2c)将步骤(2b)得到的沉淀分散于水中，加入体积比为30％的过氧化氢水溶液，使溶液中Ti4+和H2O2的摩尔比为1：3～5，Ti4+和H2O2的摩尔比优选为1:4，搅拌均匀，静置15～20小时，静置时间优选为15h，得到过氧钛酸溶胶；

(2d)将过氧钛酸溶胶在60～75℃烘干形成干凝胶，优选在75℃下烘干形成干凝胶，将干凝胶研磨成粉末，在400～600℃条件下煅烧1～2小时，优选在500℃条件下煅烧1h，得到纳米二氧化钛粉末；

(3)微量元素液的制备：将微量元素溶解于水中，得到微量元素水溶液；

(4)脂肽-纳米二氧化钛复合制剂获得：向步骤(3)得到的微量元素水溶液中，依次加入步骤(1)得到的脂肽和步骤(2)得到的纳米二氧化钛，搅拌摇匀，在20～40℃、150～250rpm条件下，振荡10～30h，优选30℃，170rpm振荡24h，即得到脂肽-纳米二氧化钛复合制剂。

步骤(1b)中，所述的发酵培养基按照如下方法等比例制备得到：称取4.5～6kg黄豆粉、3～4.5kg秸秆、0.15～0.2kg淀粉和0.15～0.2kg酵母提取物，放入发酵罐中，加入1～2L无机盐溶液，调节pH为7～8，调节培养基的含水率为40％～60％，所述无机盐溶液，其配方为：1.0g/L KH2PO4、0.5g/L MgSO4·7H2O、0.5g/L KCl、2×10-3g/L L-苯丙氨酸、5×10-3g/L MnSO4、0.16×10-3g/L CuSO4、0.15×10-3g/L FeSO4。

步骤(1b)中，发酵过程采用变温发酵，在发酵过程中保持通气量为0.1～0.5vvm、罐压为0.01～0.05Mpa，第一阶段发酵温度为25～40℃，发酵20～24h，第二阶段的发酵温度为28～40℃，发酵16～24h，且保证第二阶段发酵的温度要比第一阶段温度高0～7℃；优选先在30℃下发酵24h，然后在37℃下发酵20h。

步骤(3)中，优选的方案是将ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O的按如下浓度溶于水中：0.3～0.4g/L ZnSO4·7H2O、0.25～0.35g/L FeSO4·7H2O、0.2～0.35g/LCuSO4·5H2O和0.15～0.25g/LMnSO4·H2O，最优选将ZnSO4·7H2O、FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O的按如下浓度溶于水中：0.35g/L ZnSO4·7H2O、0.3g/L FeSO4·7H2O、0.24g/L CuSO4·5H2O和0.18g/L MnSO4·H2O。

上述脂肽-纳米二氧化钛复合制剂在防治番茄青枯病中的应用在本发明的保护范围之内。

上述脂肽-纳米二氧化钛复合制剂在促进番茄植株生长上的应用在本发明的保护范围之内。

有益效果：

1、经过红外光谱检测，本发明制备的纳米二氧化钛与脂肽和微量元素离子有效结合在一起，不仅很好的维持了脂肽的结构，提高了微量元素离子的稳定性，而且更好地发挥了脂肽的生物特性。试验表明，本发明提供的脂肽-纳米二氧化钛复合制剂对番茄青枯病的防治效果均明显高于单独使用微量元素溶液、脂肽-微量元素复合液或者纳米二氧化钛-微量元素复合液，说明脂肽-纳米二氧化钛复合制剂中纳米二氧化钛与脂肽的结合能够更好地提高脂肽的稳定性，延长脂肽的作用时间，该脂肽-纳米二氧化钛复合制剂能有效地提高番茄青枯病的防治效果。

2.本发明制备的脂肽-纳米二氧化钛复合制剂经过试验，可以促进番茄地上部和地下部的生长，与对照组相比具有显著差异，说明该脂肽-纳米二氧化钛复合制剂能够促进番茄植株生长。

3.本发明制备脂肽-纳米二氧化钛复合制剂原料之一脂肽类物质是利用固体发酵农业废弃物来生产的，本发明采用黄豆粉和秸秆混合物作为主要固体发酵基质，不仅有效提高了脂肽类物质的产量，节约了生产成本，还降低了环境压力，提高了资源的利用率。

4.本发明生产的脂肽-纳米二氧化钛复合制剂具有环境污染小，低毒、安全，生产成本低，防治和促生效果好的优点，适合番茄种植区域大面积使用。

附图说明

图1纳米二氧化钛X-射线衍射(XRD)图。

图2纳米二氧化钛透射电镜(TEM)图。

图3纳米二氧化钛扫描电镜(SEM)图。

图4样品红外光谱(FT-IR)图，图中a代表纳米二氧化钛粉末，b代表纳米二氧化钛-微量元素复合液离心干燥后的粉末，c代表脂肽-纳米二氧化钛复合制剂离心干燥后的粉末。

图5脂肽对番茄青枯病病原菌的抑菌效果图(A.2000mg/L；B.1500mg/L；C.1000mg/L)。

图6温室防治试验各处理病情指数(DI)变化图，*表示存在显著差异，NS表示不存在显著差异(p<0.05)。

图7温室防治试验各处理地上部干重，不同小写字母表示显著差异(p<0.05)。

图8温室防治试验各处理地下部干重，不同小写字母表示显著差异(p<0.05)。

图9温室促生试验各处理地上部地下部干鲜重(A.地上部鲜重；B.地下部鲜重；C.地上部干重；D.地下部干重)，不同小写字母表示显著差异(p<0.05)。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

黄豆粉和秸秆，先在60℃烘箱中烘12h去除大部分水分，磨样、粉碎，过20目筛，过筛后的样品再放入烘相中60℃烘48h至恒重，保存待用。

实施例1：

脂肽-纳米二氧化钛复合制剂的制备方法：(1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌菌株XZ-173(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，CGMCC No.4160)，划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30℃，170rpm的条件下培养24h，获得发酵种子液；称取4.5kg黄豆粉，3kg秸秆，0.15kg淀粉和0.15kg酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入1L无机盐溶液，调节基质pH为7，保证含水率为40％，将转速设为50rpm搅拌60min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括(g/L)：KH2PO41.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，L-苯丙氨酸2×10-3，MnSO4 5×10-3，CuSO4 0.16×10-3，FeSO4 0.15×10-3；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按5％(v/w，mL/g)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80％，通气量0.1vvm和罐压0.01Mpa，前24h温度设为25℃进行发酵，24h后将温度设为28℃发酵16h；称取发酵后的基质与水按1:10(w/v，g/mL)的比例混合，室温振荡1h，离心去除不溶物质，在上清液中添加HCl至pH为1，出现白色絮状沉淀，低温静置过夜，再以10000rpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

(2)纳米二氧化钛粉末制备：将硫酸钛按0.1mol/L的浓度溶于水中，加入2mol/L的氨水溶液生成白色沉淀，使溶液的最后pH为6，溶液离心后，沉淀用水洗涤数次去除残留的NH4+和SO42-，然后将白色沉淀分散于水中，加入30％的过氧化氢水溶液(Ti4+和H2O2的摩尔比为1：3)搅拌使沉淀胶溶，稳定15小时后形成黄色的过氧钛酸(PTA)溶胶，PTA溶胶在60℃烘干形成干凝胶，研磨后以400℃煅烧1小时得到纳米二氧化钛粉末；

(3)微量元素液制备：将ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O溶于水中得到微量元素液，其中ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O的含量分别0.3g/L，0.25g/L，0.2g/L和0.15g/L；

(4)脂肽-纳米二氧化钛复合制剂获得：向微量元素液中依次加入脂肽和纳米二氧化钛，其中，脂肽的含量为0.075％，纳米二氧化钛的含量为0.2％，搅拌摇匀后在摇床上以20℃，150rpm振荡10h，即得到脂肽-纳米二氧化钛复合制剂。

实施例2：

脂肽-纳米二氧化钛复合生防制剂的制备方法：(1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30℃，170rpm的条件下培养24h，获得发酵种子液；称取6kg黄豆粉，4.5kg秸秆，0.2kg淀粉和0.2kg酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入2L无机盐溶液，调节基质pH为8，含水率为60％，将转速设为70rpm搅拌80min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括(g/L)：KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，L-苯丙氨酸2×10-3，MnSO4 5×10-3，CuSO4 0.16×10-3，FeSO4 0.15×10-3；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按25％(v/w，mL/g)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80％，通气量0.5vvm和罐压0.05Mpa，温度设为40℃发酵48h；称取发酵后的基质与水按1:10(w/v，g/mL)的比例混合，室温振荡2h，离心去除不溶物质，在上清液中添加HCl至pH为3，出现白色絮状沉淀，低温静置过夜，再以10000rpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

(2)纳米二氧化钛粉末制备：将硫酸钛按0.1mol/L的浓度溶于水中，加入3mol/L的氨水溶液生成白色沉淀，使溶液的最后pH为8，溶液离心后，沉淀用水洗涤数次去除残留的NH4+和SO42-，然后将白色沉淀分散于水中，加入30％的过氧化氢水溶液(Ti4+和H2O2的摩尔比为1：5)搅拌使沉淀胶溶，稳定20小时后形成黄色的过氧钛酸(PTA)溶胶，PTA溶胶在75℃烘干形成干凝胶，研磨后以600℃煅烧2小时得到纳米二氧化钛粉末；

(3)微量元素液制备：将ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O溶于水中得到微量元素液，其中ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O的含量分别0.4g/L，0.35g/L，0.35g/L和0.25g/L；

(4)脂肽-纳米二氧化钛复合制剂获得：向微量元素液中依次加入脂肽和纳米二氧化钛，其中，脂肽的含量为0.15％，纳米二氧化钛的含量为0.3％，搅拌摇匀后在摇床上以40℃，250rpm振荡30h，即得到脂肽-纳米二氧化钛复合制剂。

实施例3：

脂肽-纳米二氧化钛复合生防制剂的制备方法：(1)脂肽粉末制备：将冷冻保藏的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株XZ-173划线于LB平板上，置于培养箱内活化，挑取单菌落接种于LB液体培养基，在30℃，170rpm的条件下培养24h，作为发酵种子液；称取5.67kg黄豆粉，3.67kg秸秆，0.17kg淀粉和0.18kg酵母提取物，放入50L发酵罐中，加入1L无机盐溶液，调节基质pH为7.5，含水率为55％，将转速设为70rpm搅拌60min充分混匀基质，灭菌；其中，无机盐溶液包括(g/L)：KH2PO4 1.0，MgSO4·7H2O 0.5，KCl 0.5，L-苯丙氨酸2×10-3，MnSO4 5×10-3，CuSO4 0.16×10-3，FeSO4 0.15×10-3；待发酵罐内温度冷却并保持稳定后，在无菌条件下按10％(v/w，mL/g)的量接入种子液，搅拌均匀，调节罐内相对湿度大于80％，通气量0.3vvm和罐压0.03Mpa，前24h温度设为30℃进行发酵，24h后将温度设为37℃发酵20h；称取发酵后的基质与水按1:10(w/v，g/mL)的比例混合，室温振荡1h，离心去除不溶物质，在上清液中添加HCl至pH为2.0，出现白色絮状沉淀，4℃静置过夜，再以10000rpm离心20min收集沉淀，沉淀用二氯甲烷进行抽提，旋转蒸发去除有机溶剂，残留物用水溶解并调pH为中性，冷冻干燥得脂肽粉末；

(2)纳米二氧化钛粉末制备：将硫酸钛按0.1mol/L的浓度溶于水中，加入3mol/L的氨水溶液生成白色沉淀，使溶液的最后pH为7，溶液离心后，沉淀用水洗涤数次去除残留的NH4+和SO42-，然后将白色沉淀分散于水中，加入30％的过氧化氢水溶液(Ti4+和H2O2的摩尔比为1：4)搅拌使沉淀胶溶，稳定15小时后形成黄色的过氧钛酸(PTA)溶胶，PTA溶胶在75℃烘干形成干凝胶，研磨后以500℃煅烧1小时得到纳米二氧化钛粉末；

(3)微量元素液制备：将ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O溶于水中得到微量元素液，其中ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，CuSO4·5H2O和MnSO4·H2O的含量分别0.35g/L，0.3g/L，0.24g/L和0.18g/L；

(4)脂肽-纳米二氧化钛复合制剂获得：向微量元素液中依次加入脂肽和纳米二氧化钛，其中，脂肽的含量为0.1％，纳米二氧化钛的含量为0.25％，搅拌摇匀后在摇床上以30℃，170rpm振荡24h，即得到脂肽-纳米二氧化钛复合制剂。

实施例4：

采用超纯水、硫酸钛(化学纯)、氨水(分析纯)、过氧化氢(分析纯)和硫酸盐(分析纯)按照实施例3的制备方法得到脂肽、纳米二氧化钛、微量元素液和脂肽-纳米二氧化钛复合制剂。

1、纳米二氧化钛-微量元素复合液的制备

向微量元素液中加入纳米二氧化钛，搅拌摇匀后在摇床上以30℃，170rpm振荡24h，即得到纳米二氧化钛-微量元素复合液。该复合液中纳米二氧化钛的质量百分比为0.25％。

2、结构表征

2.1X-射线衍射(XRD)分析：

使用日本Rigaku公司D/MAX-2500/PC X-射线衍射仪对纳米二氧化钛粉末进行分析。如图1所示，查阅PDF卡片JCPDS 21-1272，XRD图谱上标出的25.3°、37.8°、48.0°、53.8°和62.8°(2θ)处的特征峰分别对应锐钛矿(101)、(004)、(200)、(105)和(204)的晶面，同时27.4°和30.8°处不存在特征峰表明板钛矿和金红石不存在于样品中，结果表明制备出的纳米二氧化钛粉末为锐钛矿型。

2.2透射电子显微镜(TEM)和扫描电子显微镜(SEM)分析：

使用日本JEOL公司JEM-2100F 200kV透射电子显微镜和日本日立公司S-4800场发射扫描电子显微镜对纳米二氧化钛粉末的形貌尺寸进行观察和分析。如图2、图3所示，纳米二氧化钛粉末由许多10～40nm的纳米粒子聚集而成。

2.3红外光谱(FT-IR)分析：

纳米二氧化钛-微量元素复合液和脂肽-纳米二氧化钛复合制剂分别进行离心分离后，用超纯水洗涤沉淀数次，然后在60℃下干燥，研磨后将纳米二氧化钛-微量元素复合剂、脂肽-纳米二氧化钛复合制剂粉末及纳米二氧化钛粉末用KBr压片，采用Thermo Fisher IS10红外光谱仪分析主要官能团的变化，波数范围500～4000cm-1。

如图4所示，曲线(a)和(b)比较可知，纳米二氧化钛-微量元素复合液经过处理之后得到的粉末在3083cm-1和3730cm-1处出现了新的峰，为O-H基团的特征吸收，但是3083cm-1处的峰为氢键连接的O-H基团的特征吸收，同时476cm-1和1135cm-1处的Ti-O-Ti和Ti-O的特征吸收峰分别偏移到了482cm-1和1125cm-1处，表明纳米二氧化钛-微量元素复合液中微量元素离子与纳米二氧化钛结合在一起。

曲线(a)和(c)比较可知，脂肽-纳米二氧化钛复合制剂经过处理之后得到的粉末在1457cm-1，1542cm-1，1649cm-1，1717cm-1，2851cm-1、2921cm-1，3188cm-1、3621cm-1，3735cm-1处出现了新的峰，分别为CH3、酰胺谱带Ⅱ(N-H或C-N)、酰胺谱带Ⅰ(C＝O)、酮中C＝O、CH2、氢键连接的O-H、其他O-H的特征吸收，同时476cm-1和1135cm-1处的Ti-O-Ti和Ti-O的特征吸收峰分别偏移到了468cm-1和1122cm-1处，表明脂肽-纳米二氧化钛复合制剂中脂肽、微量元素离子与纳米二氧化钛结合在一起。

实施例5：脂肽和脂肽-纳米二氧化钛复合制剂对番茄青枯病病原菌的抑制活性检测。

1、番茄青枯病病原菌菌液制备。

在TTC平板上挑取番茄青枯病病原菌，接入液体NA培养基中，30℃，170rpm摇床培养至对数期，用无菌水将菌悬液稀释至106～107CFU/mL，制得试验用病原菌菌悬液。

2、抑制活性检测。将纳米二氧化钛粉末121℃，20min灭菌，微量元素液加入脂肽后过0.22μm滤膜除菌，在无菌条件下制备脂肽-纳米二氧化钛复合制剂。将病原菌菌悬液200μL均匀涂布于NA培养基平板上，然后吸取100μL不同浓度脂肽溶液(200mg/L，500mg/L，750mg/L，1000mg/L，1500mg/L，2000mg/L)注入平板上牛津杯中，30℃培养24h，观察抑菌状况并测量抑菌圈大小，重复3次。如表1和图5所示，脂肽对番茄青枯病病原菌具有较强的抑制效果，抑菌圈明显。

在无菌条件下制备含有菌悬液浓度为106CFU/mL的病原菌和不同浓度的脂肽-纳米二氧化钛复合制剂离心干燥后的粉末(0，0.15mg/mL，0.3mg/mL，0.6mg/mL，1.2mg/mL，2.4mg/mL，4.8mg/mL)的NA液体培养基试管，在黑暗或光照条件下30℃，170rpm摇床培养24小时，测定粉末的最小抑菌浓度(MIC)。结果表明，黑暗或光照条件下，脂肽-纳米二氧化钛复合制剂离心干燥后的粉末的MIC均为1.2mg/mL。

表1不同浓度脂肽溶液对番茄青枯病病原菌的抑菌能力

实施例6：

采用超纯水、硫酸钛(化学纯)、氨水(分析纯)、过氧化氢(分析纯)和硫酸盐(分析纯)按照实施例3的制备方法得到脂肽、纳米二氧化钛、微量元素液和脂肽-纳米二氧化钛复合制剂，按照实施例4的制备方法得到纳米二氧化钛-微量元素复合液。

1、脂肽-微量元素复合液的制备

向微量元素液中加入脂肽，搅拌摇匀后在摇床上以30℃，170rpm振荡24h，即得到脂肽-微量元素复合液。该复合液中脂肽的质量百分比为0.1％。

2、脂肽-纳米二氧化钛复合制剂对番茄青枯病的温室防治试验

防治试验在江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室温室大棚内进行，实验设5个处理，方案如下：(1)Control，取10ml超纯水均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部，作为对照；(2)MS，取10ml微量元素液均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部；(3)LFA，取10ml脂肽-微量元素复合液均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部；(4)LFB，取10ml纳米二氧化钛-微量元素复合液均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部；(5)LFC，取10ml脂肽-纳米二氧化钛复合制剂均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部。每个处理30盆，每盆装2kg土，施入等量氮、磷、钾化肥(包括：尿素、过磷酸钙、氯化钾)，每盆移栽1株番茄幼苗。移栽7天后在土中灌入番茄青枯病病原菌菌悬液，使病原菌浓度达到106CFU/g土以上，灌菌24小时后对番茄幼苗按上述5个处理方案进行处理1次。

在处理后第4、8、12、16、20、24、28天按病情分级标准，记录发病情况，统计各处理病情指数(DI)和防治效果，并统计处理28天后各处理植株地上部、地下部干重。

病情分级标准及病情指数计算方法如下：

0级：植株正常；1级：植株25％以下的叶片表现为萎蔫症状；

2级：植株26％～50％的叶片表现为萎蔫症状；

3级：植株51％～75％的叶片表现为萎蔫症状；

4级：植株76％以上叶片表现为萎蔫症状或植株死亡。

病情指数(DI)＝[∑(各病级植株数×各级代表数值)]/(调查总株数×最高级别数值)×100％

防治效果＝(对照病情指数-处理病情指数)/对照病情指数×100％

3、脂肽-纳米二氧化钛复合制剂对番茄青枯病的温室促生试验

促生试验在江苏省固体有机废弃物资源化高技术研究重点实验室温室大棚内进行，实验设5个处理，方案如下：(1)Control，取10ml超纯水均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部，作为对照；(2)MS，取10ml微量元素液均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部；(3)LFA，取10ml脂肽-微量元素复合液均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部；(4)LFB，取10ml纳米二氧化钛-微量元素复合液均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部；(5)LFC，取10ml脂肽-纳米二氧化钛复合制剂均匀喷施于每株番茄幼苗的叶面和茎基部。每个处理15盆，每盆装2kg土，施入等量氮、磷、钾化肥(包括：尿素、过磷酸钙、氯化钾)，每盆移栽1株番茄幼苗。移栽7天后对番茄幼苗按上述5个处理方案进行处理1次。处理30天后，统计各处理植株株高、茎粗、SPAD值和地上部地下部干鲜重。

4、结果与分析:

如表2和图6所示，随着番茄植株的生长，与其他处理相比，采取喷施脂肽-纳米二氧化钛复合制剂的病情指数很低，处理后第28天时相对防治效果为67.47％，相较于其他处理的防治效果具有显著差异，说明脂肽-纳米二氧化钛复合制剂中纳米二氧化钛与脂肽的结合能够更好地提高脂肽的稳定性，延长脂肽的作用时间，该脂肽-纳米二氧化钛复合制剂能有效地防治番茄青枯病。

如图7和图8所示，温室防治试验中处理28天后，采取喷施脂肽-纳米二氧化钛复合制剂的植株地上部和地下部干重均比其他处理高，且与对照相比具有显著差异，说明该脂肽-纳米二氧化钛复合制剂在防治番茄青枯病的同时能够促进番茄植株生长。

如表3和图9所示，温室促生试验中处理30天后，采取喷施脂肽-纳米二氧化钛复合制剂的植株株高、茎粗、SPAD值和地上部地下部干鲜重均比其他处理高，而且除了SPAD值外，其他值与Control相比均具有显著差异，说明该脂肽-纳米二氧化钛复合制剂能够促进番茄植株生长，与其他处理方式相比，采取喷施脂肽-纳米二氧化钛复合制剂能更好地促进番茄植株生长。

表2温室防治试验不同处理对番茄青枯病的防治效果

注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)

表3温室促生试验中各处理植株的株高、茎粗和SPAD值

注：不同小写字母表示显著差异(p<0.05)。

本文标签： 制剂制备方法纳米二氧化钛