抗微生物组合物及相关方法

admin管理员组

文章数量:866648

要求保护的发明涉及有效预防微生物污染或降低与污染表面有关的微生物计数的组合物和方法，包含杀生物系统，所述杀生物系统包含主杀生物剂、pH缓冲剂、表面活性剂，均在水基载体中，其中所述组合物可被认为是环境友好的。

1.用于预防微生物污染或减少与污染表面有关的微生物计数的组合物，所述组合物包含：a.0.10％至1.0%重量的N-(C-C烷基)杂芳基铵盐；b.至少0.05％至2％重量的pH缓冲剂，其中所述pH缓冲剂是杀生物、皮肤用、非腐蚀性的酸组合物，具有1.0×10-9.9×10的质子数范围、从250mV到1500mV的内含电导率范围，且在pH缓冲剂以0.1%重量的浓度存在时具有小于2.0的pH；和c.0.35％至5％重量的PEG6；d.0.5％至4.0％重量的增稠剂；d.余量为水基载体，以及e.痕量的辅助成分。 2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述N-(C-C烷基)杂芳基铵盐选自十六烷基氯化吡啶、十六烷基溴化吡啶和十六烷基吡啶氢硫化物。

相关申请的交叉引用

本申请是申请日2012年11月6日、申请号201280066194.4、发明名称“抗微生物组合物及相关方法”的中国专利申请的分案申请。本申请要求2011年11月6日提交的美国临时专利申请序号61/556,264、2011年11月6日提交的美国临时专利申请序号61/556,241，以及2011年11月6日提交的美国临时专利申请序号61/556,247根据35 U.S.C. § 119(e)的权益，所有这些专利申请通过引用而全文结合至本文，如同在本文中完全阐述一样。

技术领域

本公开内容涉及有效预防微生物污染或降低污染表面上或污染表面中微生物计数的组合物和方法。

背景技术

在多种表面上，霉菌(mold)、霉(mildew)、真菌、病毒和细菌(微生物)污染是不希望的。所述微生物污染的控制主要基于使用具有有限功效的杀生物剂(biocides)，并且可能对环境具有有害影响。因此，希望使用在微生物控制中可能更加有效的更有效杀生物剂或其衍生物。额外益处可能是组合物可为环境友好的，这在某些应用中也是合乎需要的。

季铵化合物的抗微生物特性通常是已知的。所述化合物已经广泛用于家庭和工业应用的清洁组合物中。然而，由于它们可对环境有害，并且有效性极低，在清洁组合物中可优选使用较少量的这些化合物。因此，产生包含显示抗微生物特性并且可同时为环境友好的化合物的制剂是合乎需要的。

发明内容

要求保护的发明涉及有效预防微生物污染或降低污染表面上或污染表面中微生物计数的组合物和方法。

所公开的组合物包含杀生物系统，所述杀生物系统在水基载体中包含主杀生物剂、pH缓冲剂和表面活性剂。

本发明的实施方案涉及组合物，所述组合物包含：

a. 约0.01％至约20.0%重量的杀生物系统，其包含：

i. 约0.01％至约25%重量的主杀生物剂；和

ii. 至少约0.01％至约25％重量的pH缓冲剂，其中所述pH缓冲剂是杀生物、皮肤用、非腐蚀性的酸组合物，具有1.0×1020-9.9×1026的质子数范围、从250mV到1500mV的内含电导率(embodied conductivity)范围，且在pH缓冲剂以0.1%重量的浓度存在时具有小于2.0的pH；和

b. 约0.01％至4.0％重量的表面活性剂；且

c. 余量为水基载体。

示范性实施方案的详细说明

在本说明书和所附权利要求书中，将提及许多术语，所述术语应被定义为具有以下含义：

在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包含”或变体例如“包括”或“含有”将被理解为暗示包括所述整数或步骤或者整数或步骤组，但不排除任何其他整数或步骤或者整数或步骤组。

必须注意到，当在本说明书和所附权利要求书中使用时，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指示物，除非上下文另有明确规定。因此，例如，提及“一种载体”包括两种或多种此类载体的混合物等等。

范围在本文中可以表示为从“约”一个特定值和/或到“约”另一个特定值。当表示这样的范围时，另一个方面包括从一个特定值和/或到其他特定值。类似地，当数值通过使用先行词“约”作为近似值表示时，应理解特定值形成另一个方面。还应理解，每个范围的端点在与其他端点相关联以及独立于其他端点两方面都很重要。

本文使用“混合物”或“共混物”一般意指两种或多种不同组分的物理组合。

“接触”意指将组合物施用至污染表面的情况。

本文使用“污染”描述微生物的侵扰，例如在任何材料的表面中或表面上存在毒素或病原体。

本文使用“控制释放”意指使用材料以调节其他物质的释放。

本文使用“有效量”意指本文公开的组合物的量，其在获得期望结果所必需的剂量和时间时有效。

本文使用“环境友好”指绿色、有机或天然组合物，其对环境有害程度最低。

本文使用“赋形剂”以包括可能被包含于微粒之中或微粒上的任何其他化合物，其并非治疗上或生物学上的活性化合物。因此，赋形剂应当是药学上或生物学上可接受的或相关的(例如，赋形剂应通常对受试者是无毒的)。“赋形剂”包括单个的所述化合物，并且也预期包括多种赋形剂。

本文使用“微生物学的”指有害微生物例如霉菌、霉、病毒或细菌污染的任何包含或增长。

本文使用“微生物计数”指存在于任何表面上的微生物污染物的量或数目。

“任选的”或“任选地”指随后描述的事件或状况可发生或者可不发生，并且该描述包括所述事件或状况发生的情况以及它不发生的情况。

本文使用“主杀生物剂”指对微生物污染物有生物学活性的组合物。

本文使用“主病原体”指可在表面上引起污染的霉菌、霉、细菌、病毒或其他微生物。

“足够量”和“足够时间”意指获得期望结果所需的量和时间，所述结果为例如控制和/或预防微生物污染。

本文使用“表面”指包含微生物污染的物体。术语表面可适用于整个物体、物体的一部分或一层，并且直至物体的分子结构。

除非有明确地相反陈述，否则组分的“重量百分数”是基于将所述组分包含于其中的制剂或组合物的总重量。

本公开内容针对以下定义的数个未满足的需求提出解决方案：

1. 提供有效杀灭一种或多种细菌性病原体的组合物。非限制性实例包括沙门氏菌(Salmonella)、绿脓假单胞菌(Psudomonas aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermdis)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、假单胞菌(Pseudomonas species)、空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni)、大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumonia)。

2. 提供有效杀灭一种或多种病毒病原体的组合物。非限制性实例包括隐孢子虫(Cryptosporidium)、蓝氏贾第鞭毛虫(Giardia lamblia)、脊髓灰质炎(poliomyelitis)、脑膜炎(meningitis)和肠胃炎(gastroenteritis)、轮状病毒(Rotaviruses)、诺瓦克病毒(Norwalk)、诺如病毒(Norovirus)、甲型肝炎(Hepatitis A)、寄生虫。

3. 提供有效杀灭一种或多种霉菌和霉孢子病原体的组合物。非限制性实例包括须发癣菌(Trichophyton mentagrophytes)、柑橘球座菌(Guignardia citricarpa)和尖孢炭疽菌(Colletotrichum acutatum)。

4. 提供替换基于氯和氯的产品例如基于次氯酸钠的处理的组合物。

处理组合物

本发明的组合物一般包括杀生物系统，其包含主杀生物剂和pH缓冲组分。主杀生物剂根据所寻求控制的微生物的性质进行选择，例如季铵盐。将pH缓冲剂机械融合以帮助递送杀生物剂而不引起对被处理表面的损害。举例来说，适合的pH缓冲剂在美国专利No.7,824,524中公开，通过引用将其全部并入本文，或者在标题为“Reactive, non-corrosive and dermal-friendly composition and methods for manufacturing”的美国专利申请No.13/346,160中公开，也通过引用将其全部并入本文。在本发明的实施方案中，选择与主杀生物剂具有相容性的pH缓冲剂。

本发明的实施方案涉及有效预防或减少微生物计数的组合物，所述组合物包含：

a. 约0.01％至约20.0%重量的杀生物系统，其包含：

i. 约0.01％至约25%重量的主杀生物剂；和

ii. 至少约0.01％至约25％重量的pH缓冲剂，其中所述pH缓冲剂是杀生物、皮肤用、非腐蚀性的酸组合物，具有1.0×1020-9.9×1026的质子数范围、从250mV到1500mV的内含电导率(embodied conductivity)范围，且在pH缓冲剂以0.1%重量的浓度存在时具有小于2.0的pH；和

b. 约0.01％至4.0％重量的表面活性剂；且

c. 余量为水基载体。

然而，如本文进一步公开的那样，其他非限制性实施方案和组合也是可能的。

杀生物系统

所公开的组合物包含杀生物系统。所述杀生物系统包含主杀生物剂和pH缓冲剂。在本发明的某些实施方案中，所公开的组合物包含约0.01%至约20.00%重量的杀生物系统。在其他实施方案中，所述杀生物系统包含至少约25%重量的主杀生物剂和至少约25%重量的pH缓冲剂组分。选择与主杀生物剂具有相容性的pH缓冲剂。

主杀生物剂

第一组合适的杀生物剂包括季铵化合物，选自(C12-C14烷基)(C1-C2二烷基)苄基铵盐、N-(C12-C18烷基)杂芳基铵盐和N-[(C12-C14烷基)(C1-C2二烷基)]杂芳基亚烷基铵盐。(C12-C14烷基)(C1-C2二烷基)苄基铵盐的非限制性实例包括(C12-C14烷基)二甲基苄基氯化铵、(C12-C14烷基)二甲基苄基溴化铵和(C12-C14烷基)二甲基苄基硫酸氢铵。N-(C12-C18烷基)杂芳基铵盐的非限制性实例包括氯化十六烷基吡啶、溴化十六烷基吡啶和十六烷基吡啶氢硫化物。对于N-(C12-C18烷基)杂芳基铵盐，可以使用其他阴离子。

适合用作主杀生物剂的季铵化合物的其他实例包括十六烷基三甲基氯化铵、硬脂基三甲基氯化铵、异硬脂基三甲基氯化铵、月桂基三甲基氯化铵、二十二烷基三甲基氯化铵、十八烷基三甲基氯化铵、椰油基三甲基氯化铵(cocoyltriinethylammonium chloride)、十六烷基三甲基溴化铵、硬脂基三甲基溴化铵、月桂基三甲基溴化铵、异硬脂基月桂基二甲基氯化铵、双十六烷基二甲基氯化铵、二硬脂基二甲基氯化铵、二椰油基二甲基氯化铵、葡糖酰胺基丙基二甲基羟乙基氯化铵、二[聚氧乙烯(2)]油烯基甲基氯化铵、十二烷基二甲基乙基氯化铵、辛基二羟乙基甲基氯化铵、三[聚氧乙烯(5)]硬脂基氯化铵、聚氧丙烯甲基二乙基氯化铵、月桂基二甲基(乙基苄基)氯化铵、二十二酰胺基丙基-N,N-二甲基-N-(2,3-二羟基丙基)氯化铵、二氯化牛脂基二甲基铵基丙基三甲基铵和苯扎氯铵。

第二组合适的杀生物剂包括铜、锌、银的盐酸盐、亚氯酸盐、高氯酸盐、次氯酸盐、硫酸盐、亚硫酸盐、硫酸氢盐、亚硫酸氢盐、硝酸盐、亚硝酸盐和氢氧化物。胶体金属例如银、金、铜和锌也具有优良的杀生物特性。将胶态的银、金、铜和锌提取并形成为超细(0.010-0.001微米)的颗粒。

第三组合适的杀生物剂包括有机酸，这些有机酸根据食品生产的FDA GRAS指南是安全的，但是仍然有效的控制细菌。有机酸对细菌的基本原理作用为非解离的有机酸能够渗透细菌细胞壁并且由于细菌不能耐受宽的内部和外部的pH梯度而引起破裂。这将引起细胞内的渗透压增加，该状态不适宜细菌存活。

第一组合适的有机酸是乳酸、乙酸、甲酸、富马酸、柠檬酸、草酸、己二酸和尿酸。

第二组合适的有机酸是羧酸，其酸性与其羧基-COOH关联。含有基团- SO2OH的磺酸是相对较强的酸。酸的共轭碱的相对稳定性决定了它的酸性。在某些生物系统中，形成更复杂的有机酸例如L-乳酸、柠檬酸和D-葡糖醛酸。这些酸使用羟基或羧基。

第三组合适的有机酸是腐殖酸、癸二酸、硬脂酸、没食子酸、棕榈酸、咖啡酸、乙醛酸、富啡酸、鼠尾草酸、邻氨基苯甲酸、鞣花酸、硫辛酸、绿原酸、迷迭香酸、磷酸、甲基丙烯酸、齐墩果酸(Oleanic)、硝基腐殖酸、氟代肉桂酸(Florocinnamic)、六氟硅酸(Hexaflorosilicic)、氢氟酸、羟基柠檬酸和硅氟酸。

第四组合适的有机酸是水果酸。水果中的酸主要是醋酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、草酸，在某些情况下是硼酸。苹果酸存在于苹果、梨、红醋栗、黑莓、覆盆子、榅桲(quince)、菠萝、樱桃和大黄中。柠檬酸发现于柠檬、橙子、葡萄柚、柠檬、酸橙、榅桲、醋栗、草莓、覆盆子、葡萄干和蔓越橘中。酒石酸存在于葡萄中。硼酸发现于许多新鲜水果和蔬菜中。扁桃酸存在于扁桃仁中。

第五组合适的有机酸是β羟基酸，β羟基酸是一种酚酸。水杨酸是一种无色结晶的有机酸，从该来源获得的其主要活性成分是单羟基苯甲酸。

第六组合适的有机酸是一类破坏生物膜的产品。生物膜是围绕细菌的保护层/屏障。一些物种不能凭其自身附着到表面上，但通常能够将其自身锚定在基质或细菌细胞上。正是在这种建群过程中，细胞能够通过其群体感应能力进行通讯。一旦开始建群，生物膜通过细胞分裂和募集的组合进行生长。生物膜形成的最后阶段被称为发展，并且是在其中建立生物膜并且仅可改变形状和尺寸的阶段。生物膜的发展可使聚集的细胞集落越来越有抗性。生物膜的硬质保护表面可被乳酸杆菌sc乳链菌肽(Lactobacillus sc Nisin)破坏，该乳酸杆菌sc乳链菌肽使用细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)通过发酵产生。这是在天然底物例如牛奶或葡萄糖上由乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)的培养获得的，不是化学合成的。这是一种由食品级乳制品起子细菌乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)产生的肽。

第七组合适的有机酸是天然酶。酶是催化化学反应的蛋白质，其范围仅从62个氨基酸残基开始。通常，这些酶是蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶和纤维素酶。酶通常对其催化的反应和参与这些反应的底物非常有专一性。形状、电荷和亲水性/疏水性表征酶。

pH缓冲剂

pH缓冲剂是杀生物、皮肤用、非腐蚀性的酸组合物，具有1.0× 1020-9.9× 1026的质子数范围、从250mV到1500mV的内含电导率范围以及0.1%的pH在2.0以下的组合物溶液。

表面活性剂

所公开的组合物包含约0.05%至约5.0%重量的、具有约5至约30的HLB的阳离子表面活性剂。所公开的组合物的一个方面包含具有约12至约18的HLB的阳离子或离子型表面活性剂。所公开的组合物的其他方面包含具有约13至约16的HLB的阳离子或离子型表面活性剂。所公开的组合物的另一个实施方案包括约0.1%至约4.0%重量的阳离子或离子型表面活性剂。

用于所公开的组合物中的适合的阳离子或离子型表面活性剂包括聚氧乙烯C6-C12烷基苯基醚，聚氧乙烯脱水山梨醇三(C12-C18)-链烷酸酯，聚氧乙烯脱水山梨醇二(C12-C18)-链烷酸酯，聚氧乙烯脱水山梨糖醇单-、双和三(C12-C18)-链烷酸酯和聚氧乙烯C12-C20烷基醚。

用于所公开的组合物中的一类适合的阳离子或离子型表面活性剂为具有下式的聚氧乙烯C6-C12烷基苯基醚：

其中Y为C6-C12烷基单元并且n为5至40的指数。C6-C12烷基苯基醚的非限制性实例包括以商品名IGEPAL™ CA-520和IGEPAL™ CO-520销售的聚氧乙烯(5) 异辛基苯基醚，以商品名TRITON™ X-114销售的聚氧乙烯(8) 异辛基苯基醚，以商品名IGEPAL™ CO-630销售的聚氧乙烯(9) 壬基苯基醚，以商品名TRITON™ X-100销售的聚氧乙烯(10) 异辛基苯基醚，以商品名TRITON N-101销售的聚氧乙烯(支链)壬基苯基醚，以商品名IGEPAL™ CO-720销售的聚氧乙烯(12)壬基苯基醚，以商品名IGEPAL™ CA-720销售的聚氧乙烯(12) 异辛基苯基醚，以商品名IGEPAL™ CO-890销售的聚氧乙烯(40)壬基苯基醚，和以商品名TRITON™ X-405销售的聚氧乙烯(40)异辛基苯基醚。

用于所公开的组合物中的另一类阳离子或离子型表面活性剂为聚氧乙烯脱水山梨醇单-、二-和三-(C12-C18)-链烷酸酯，其非限制性实例包括以商品名TWEEN™ 85销售的聚氧乙烯(20) 脱水山梨醇三油酸酯，以商品名TWEEN™ 80销售的聚氧乙烯(20) 脱水山梨醇单油酸酯，以商品名TWEEN™ 60销售的聚氧乙烯(20) 脱水山梨醇单硬脂酸酯，以商品名TWEEN™ 40销售的聚氧乙烯(20) 脱水山梨醇单棕榈酸酯，和以商品名TWEEN™ 20销售的聚氧乙烯(20) 脱水山梨醇单月桂酸酯。

用于所公开的组合物中的另一类阳离子或离子型表面活性剂为聚氧乙烯C9-C20烷基醚，其非限制性实例包括具有式RO(CH2CH2O)mH的乙氧基化醇，其中R为具有6至20个碳原子的直链或支链烷基并且m为约2至约20的整数。适合的乙氧基化醇表面活性剂的一个实例为来自Shell Chemicals的NEODOL™乙氧基化醇。适合的乙氧基化醇的非限制性实例包括NEODOL™ 91-5、NEODOL™ 91-6、NEODOL™ 91-8、NEODOL™ 91-9、NEODOL™ 23-6.5、NEODOL™ 25-5、NEODOL™ 25-7、NEODOL™ 25-9、NEODOL™ 25-12、NEODOL™ 45-7和NEODOL™ 135-7。

载体

所公开的组合物的余量包括载体。所述载体可以是任何合适的材料，其可溶解活性成分和共-成分(co-ingredients)，并将杀生物系统递送至被感染区域。对所公开的组合物的液体实施方案来说，水是方便的载体。

辅助成分

所公开的组合物可以约0.001%至0.5%的水平进一步包含一种或多种染料。适合染料的非限制性实例为Alizarine Light Blue B (C.I. 63010)、Carta Blue VP (C.I. 24401)、酸性绿2G (C.I. 42085)、Astrogen Green D (C.I. 42040)、Supranol Cyanine 7B (C.I. 42675)、Maxilon Blue 3RL (C.I.碱性蓝80)、Drimarine Blue Z-RL (C.I. 活性蓝18)、Alizarine Light Blue H-RL (C.I. 酸性蓝182)、FD&C蓝No. 1和FD&C绿No. 3. (参见美国专利No. 4,248,827 和美国专利No. 4,200,606，二者通过引用并入本文)。

可使用的可为色淀的其他着色剂(color)为FD&C蓝No. 1 -亮蓝FCF，(蓝色调)，FD&C蓝No. 2 –靛蓝，(深蓝色调)，FD&C绿No. 3 – 固绿FCF，(青绿色调)，FD&C红No. 40 - Allura红AC，(红色调)，FD&C红No. 3 – 赤藓红，(粉红色调，通常用于糖衣樱桃)，FD&C黄No. 5 – 酒石黄，(黄色调)，FD&C黄No. 6 - 日落黄FCF，El 10(橙色调)。

适用于本文公开的组合物中的其他辅助成分包括香料。

制剂

表I

成分 量(wt%) 苹果酸 0.15-1.50 pH缓冲剂 0.05-2.00 增稠剂 0.50-4.00 载体 余量 辅助成分 痕量

表II

成分 含量(wt%) 氯化十六烷基吡啶 0.10-1.0 pH缓冲剂 0.05-2.0 PEG 6 0.35-5.0 增稠剂 0.25-4.0 载体 余量 辅助成分 痕量

表I显示了根据本发明实施方案配制的环境友好的组合物，包含有机酸代替了季铵盐。

使用方法

所公开的组合物可被用于多种应用。应用途径和给药方案通过微生物污染物的类型和量确定。作为本发明可能应用的实例，所述组合物可用于多种污染表面上以减少对与所述表面接触的人和动物的感染或污染。所述组合物可被用作清洁剂、擦洗剂(具有磨擦特性的清洁剂)、喷雾、泡沫、雾剂或凝胶。

有效量可根据本领域已知的因素变化，例如微生物污染物的类型、微生物计数和被处理表面的类型。虽然在本文实施例中可描述特定的给药方案，但是本领域技术人员将会理解，可以改变给药方案以提供最佳治疗响应。例如，可以每天给予数个分隔的剂量，或者剂量可以根据污染表面的紧急情况所指示而按比例降低。此外，本公开内容的组合物可根据需要频繁给药以获得期望的结果。

工作实施例

下列程序用于评价所公开的组合物对抗多种微生物污染物。在下列每个实施例中所测试的组合物均包含0.25wt%的苹果酸、0.10wt%的pH缓冲剂和0.5wt%的增稠剂。下面的结果进一步显示所公开的组合物的有效性。

使用金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) ATCC #6538进行细菌试验。结果列于表A中。细菌生长的减少为99.9999%。

表A

种类 对照单位 结果单位 金黄色葡萄球菌 7.9×107 cfu/ml 2.5 cfu/ml

在Biological Consulting Services of North Florida, Inc.，完成了对大肠杆菌(E. coli)(ATCC 15597)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enterica) (ATCC BAA-711)和甲氧苯青霉素抗性金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) (MRSA; BAA-44)的细菌试验。结果列于表B中。

表B

样品 对照单位(cfu/ml) 结果单位(cfu/ml) 大肠杆菌 9.3×105 < 0.5 肠炎沙门氏菌(S. enterica) 1.1×106 < 0.5 MRSA 1.0×106 < 0.5

在Biological Consulting Services of North Florida, Inc.，完成了对下列正粘病毒(Orthomyxviridie virus) ATCC型CCL-34、流感A/Equi 2 (ATCC VR517)脊髓灰质炎病毒1 (Chat; ATCC VR-1562)和鼻病毒(Rhinovirus) 39 (ATCC VR-340)的病毒试验。病毒试验的结果在表C中显示。

表C

样品 对照单位 结果单位 正粘病毒 6.2×106 < 200 cfu/ml 流感A(H1N1) 3.1×104 < 200 cfu/ml 脊髓灰质炎病毒1 1.6×105 2.1×10^1 鼻病毒39 6.7×105 < 200cfu/ml

在Biological Consulting Services of North Florida, Inc.，完成了对下列须发癣菌ATCC 4807、柑橘球座菌ATCC 26254和尖孢炭疽菌(ATCC 38689)的霉菌和真菌试验。霉菌和真菌试验的结果在表D中显示。

表D

样品 对照单位(cfu/ml) 结果单位(cfu/ml) 须发癣菌 1.1×104 < 1.0 柑橘球座菌 1.9×104 < 1.0 尖孢炭疽菌 1.5×104 < 1.0

尽管已经举例说明和描述了本公开内容的特定实施方案，但是对本领域技术人员来讲，可在不脱离本公开内容的精神和范围的情况下进行各种其它的变化和修改将是显而易见的。因此，在本公开内容范围内的所有这些变化和修改旨在涵盖在所附权利要求书中。

本文标签： 组合微生物方法