促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法

admin管理员组

文章数量:866648

本发明公开了一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，包括：步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50‑400μmol/L；步骤二、栽培罗汉果植株，将浓度为50‑400μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20‑30d的罗汉果表面；在每次喷洒时，预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶液降温至8℃；每次喷洒之前，先向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为10℃，每次喷洒之后，再向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为15℃，之后通风。本发明通过在罗汉果组培苗和栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯，短期内快速诱导罗汉果甜苷V生物合成途径中关键酶基因UGT84A21的高表达。

1.一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，其特征在于，包括：步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50-400μmol/L；步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为50-400μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20-30d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d；并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时，预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶液降温至8℃；每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为10℃，每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为15℃，之后通风。 2.如权利要求1所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述培养条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度21-25℃条件下培养30d。 3.如权利要求2所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，其特征在于，所述的固体培养基配比为MS+6-BA1.5mg/L，IBA0.3mg/L，琼脂3.5g/L，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/L。 4.如权利要求3所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，其特征在于，所述步骤一中，所述含有茉莉酸甲酯的固体培养基通过以下方式制备得到：用体积百分比浓度为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50-400μmol/L，将固体培养基灭菌并冷却至24-26℃。 5.如权利要求1所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，其特征在于，还包括：步骤三、利用qRT-PCR检测所述步骤二栽培得到的罗汉果果实中的UGT84A21基因表达。 6.如权利要求5所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，其特征在于，所述步骤三中，采用改良Trizol法提取罗汉果果实总RNA。

技术领域

本发明涉及基因技术，尤其涉及一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法。

背景技术

罗汉果甜苷V属于葫芦烷型四环三萜类物质，罗汉果甜苷V生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(IPP)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(DMAPP)，二者是通过甲羟戊酸(MVA)和甲基赤藓糖醇磷酸化(MEP)两条途径形成，MVA途径发生在胞质中，MEP途径发生在质体中。来源于上述两途径的IPP或DMAPP经牻牛儿基焦磷酸合酶(GPS)催化形成牻牛儿基焦磷酸(GPP)，IPP与GPP在法呢基焦磷酸合酶(FPS)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(FPP)，然后经角鲨烯合酶(SS)、角鲨烯环氧化酶(SE)的催化形成2,3-氧化角鲨烯，葫芦二烯醇合酶(CS)进一步催化形成葫芦二烯醇，最后在CYP450酶和葡萄糖基转移酶(UGT)的作用下，形成罗汉果甜苷V。

异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。作为异戊二烯途径中的限速酶，UGT基因的表达对罗汉果甜苷V的生物合成起着决定性作用。过表达UGT基因，可以促进罗汉果甜苷V的积累；相反，如果抑制UGT基因的表达，罗汉果甜苷V的产量将显著降低。现有技术中未见有促进罗汉果UGT84A21基因表达的报道。

发明内容

针对上述技术问题，本发明设计开发了一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法。

本发明提供的技术方案为：

一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，包括：

步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50-400μmol/L；

步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为50-400μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后20-30d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d；并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时，预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶液降温至8℃；每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为10℃，每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为15℃，之后通风。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法中，所述步骤一中，所述培养条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度21-25℃条件下培养30d。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法中，所述的固体培养基配比为MS+6-BA 1.5mg/L，IBA 0.3mg/L，琼脂3.5g/L，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/L。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法中，所述步骤一中，所述含有茉莉酸甲酯的固体培养基通过以下方式制备得到：用体积百分比浓度为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50-400μmol/L，将固体培养基灭菌并冷却至24-26℃。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，还包括：

步骤三、利用qRT-PCR检测所述步骤二栽培得到的罗汉果果实中的UGT84A21基因表达。

优选的是，所述的促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法中，所述步骤三中，采用改良Trizol法提取罗汉果果实总RNA。

本发明通过在罗汉果组培苗和栽培罗汉果施加茉莉酸甲酯，短期内快速诱导罗汉果甜苷V生物合成途径中关键酶基因UGT84A21的高表达，从而促进罗汉果甜苷V含量的显著提高。本发明操作简便，成本低，对环境友好，适于规模化生产，具有较强的实用性和推广价值。

具体实施方式

下面对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。

实施例一

一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，包括：

步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为50μmol/L。所述培养条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度21℃条件下培养30d。所述的固体培养基配比为MS+6-BA 1.5mg/L，IBA 0.3mg/L，琼脂3.5g/L，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/L。

所述含有茉莉酸甲酯的固体培养基通过以下方式制备得到：用体积百分比浓度为2％的乙醇水溶液溶解茉莉酸甲酯，配制成10000μmol/L的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到固体培养基中，至茉莉酸甲酯的最终浓度为50μmol/L，将固体培养基灭菌并冷却至24-26℃。

步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为50μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后22d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d；并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时，预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶液降温至8℃；每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为10℃，每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为15℃，之后通风。

步骤三、利用qRT-PCR检测所述步骤二栽培得到的罗汉果果实中的UGT84A21基因表达。

先将罗汉果果实进行处理，挑取果肉，切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用。

采用改良Trizol法提取罗汉果果实总RNA。

采用ABI7500实时荧光定量PCR仪。

将RNA反转录为cDNA的反应体系为RNA 10.0μL，PrimeScript RT Enzyme Mix I 1.0μL，RT Primer Mix 1.0μL，5×PrimeScript Buffer 2 4.0μL，RNase Free dH2O 4.0μL；反应条件为37℃(15min)到85℃(5s)，再到4℃。

采用Primer Premier 5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。其中，UGT84A21引物序列为(FP：CGCCATATGCACCACCACCACCACCACATGGTAAAGGAAGTTGCAGATG(SEQ ID NO:1)，RP：CCGAGCTCTCAAGAAGTCGCCGAACAATGG(SEQ ID NO:2))，内参基因用UBQ5，序列为(FP：ATAAAAGACCCAGCACCACATTC(SEQ ID NO:3)，RP：CCCTTGCCGACTACAACATCC(SEQ ID NO:4))。

qRT-PCR反应体系(20μL)为SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)10.0μL，PCR Forward Primer(10μM)0.8μL，PCR Reverse Primer(10μM)0.8μL，ROX Reference Dye of Dye II(50×)0.4μL，Template 2.0μL，dH2O 6.0μL。反应条件为95℃(30s)，接着进行40个cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。采用HPLC法测定罗汉果甜苷V的含量。色谱条件为：色谱柱：DIKMA Diamomsil(TM)C18(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：乙腈-水(梯度0-40min；10％线性升至40％；40.01-45mm；回至10％)；流速：1.0ml/min，检测波长：203nm。供试品样液的配制为：取罗汉果粉末2g，精密称定，置于100ml具磨口塞锥形瓶中，精密加入甲醇25ml，摇匀，称定重量。超声处理1h，放冷，再称定重量，并用甲醇补足减失的重量，摇匀，以0.45μm的滤液微孔滤膜过滤即可。

对比例一

步骤一、将罗汉果组培苗接种不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养；步骤二、不对罗汉果植株喷洒茉莉酸甲酯；其他条件与实施例一一致。

qRT-PCR检测结果显示，在对比例一中，罗汉果UGT73AF1基因的表达量为1，而在实施例一中，罗汉果UGT73AF1基因的表达量高达10.8，较对比例一提高了980％，可见，实施例一可以显著促进罗汉果UGT73AF1基因的高表达。HPLC检测结果显示，在对比例一中，罗汉果甜苷V含量为0.79％，而在实施例一中，罗汉果甜苷V含量高达2.13％，较对比例一提高了169.62％，可见，实施例一还可以显著促进罗汉果甜苷V产量的提高。

实施例二

一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，包括：

步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为200μmol/L。所述培养条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度25℃条件下培养30d。所述的固体培养基配比为MS+6-BA 1.5mg/L，IBA 0.3mg/L，琼脂3.5g/L，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/L。

步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为200μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后24d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d；并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时，预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶液降温至8℃；每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为10℃，每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为15℃，之后通风。

其他条件均与实施例一一致。

对比例二

步骤一、将罗汉果组培苗接种于不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养；步骤二、不对罗汉果植株喷洒茉莉酸甲酯；其他条件与实施例二一致。

qRT-PCR检测结果显示，在对比例二中，罗汉果UGT73AF1基因的表达量为1，而在实施例二中，罗汉果UGT73AF1基因的表达量高达17.9，较对比例二提高了1690％，可见，实施例二可以显著促进罗汉果UGT73AF1基因的高表达。HPLC检测结果显示，在对比例二中，罗汉果甜苷V含量为0.78％，而在实施例二中，罗汉果甜苷V含量高达2.24％，较对比例二提高了187.18％，可见，实施例二还可以显著促进罗汉果甜苷V产量的提高。

实施例三

一种促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法，包括：

步骤一、罗汉果组培苗接种在含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养，其中，茉莉酸甲酯在固体培养基中的浓度为300μmol/L。所述培养条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux，光照时间8h/d，温度25℃条件下培养30d。所述的固体培养基配比为MS+6-BA 1.5mg/L，IBA 0.3mg/L，琼脂3.5g/L，蔗糖30g/l，活性炭1.0g/L。

步骤二、栽培所述步骤一培养得到的罗汉果植株，在栽培期间，将浓度为300μmol/L的茉莉酸甲酯喷洒于授粉后28d的罗汉果表面，至表面滴水为止，早、中、晚各喷洒一次，连续喷施5d；并且在每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液时，预先将茉莉酸甲酯的乙醇溶液降温至8℃；每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之前，先向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为10℃，每次喷洒茉莉酸甲酯的乙醇溶液之后，再向罗汉果表面喷水雾，水雾温度为15℃，之后通风。

其他条件均与实施例一一致。

对比例三

步骤一、将罗汉果组培苗接种于不含有茉莉酸甲酯的固体培养基中培养；步骤二、不对罗汉果植株喷洒茉莉酸甲酯；其他条件与实施例三一致。

qRT-PCR检测结果显示，在对比例三中，罗汉果UGT73AF1基因的表达量为1，而在实施例三中，罗汉果UGT73AF1基因的表达量高达15.3，较对比例三提高了1430％，可见，实施例三可以显著促进罗汉果UGT73AF1基因的高表达。HPLC检测结果显示，在对比例三中，罗汉果甜苷V含量为0.71％，而在实施例三中，罗汉果甜苷V含量高达2.11％，较对比例三提高了197.18％，可见，实施例三还可以显著促进罗汉果甜苷V产量的提高。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

SEQUENCE LISTING

<110> 李华政

<120> 促进罗汉果UGT84A21基因表达的方法

<130> 2016

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgccatatgc accaccacca ccaccacatg gtaaaggaag ttgcagatg 49

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ccgagctctc aagaagtcgc cgaacaatgg 30

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ataaaagacc cagcaccaca ttc 23

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccttgccga ctacaacatc c 21

本文标签： 罗汉果基因方法