一种降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法

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本发明属于果树脱毒种苗繁育技术领域，特别涉及一种降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法。采用1％高锰酸钾水溶液浸泡八棱海棠种子，进行沙藏、播种、获取无病毒苗木繁育的基砧。包括以下步骤：(1)种子采集；(2)高锰酸钾处理；(3)播种；(4)实生苗优选与病毒抽检。使用本发明的技术方法，八棱海棠种子出苗率达到47.6％，病毒脱除率达到95％，节省育苗用海棠种子50％，大大节约了生产成本。

1.一种降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，其特征在于：采用1％高锰酸钾水溶液浸泡八棱海棠种子，进行沙藏、播种、获取无病毒苗木繁育的基砧。 2.一种权利要求1所述的降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)种子采集：在健康、无病害的树上，采收果实成熟后的八棱海棠种子；将果实环状切开，取出种子用清水清洗2遍，去除果肉和种子表面的果胶，阴干后，放干燥通风处保存；(2)高锰酸钾处理：在1月上旬，将种子放入1％高锰酸钾水溶液浸泡30分钟，用自来水冲洗2次，晾干后，放置在背阴处沙藏；(3)播种：在3月中下旬，在平均气温5-7℃时开始播种；播种量1.5-2.0Kg/666.7m；播种后，待苗长至2-3片真叶时，开始浇水，进行正常田间管理；(4)实生苗优选与病毒抽检：待苗高8-10cm时，对苗圃中生长势弱、发育不正常、有明显病害的实生海棠苗及时去除，同时疏除生长过密的苗木，保持通风，株距保持在10-15cm；8月中下旬，对海棠苗木进行随机选取幼叶进行苹果病毒检测；抽检完毕后，所得砧木即可作为苹果无病毒苗木繁育的基砧。 3.一种权利要求2所述的降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，其特征在于：在步骤(2)的沙藏中，种子与沙的比例在1：3-1：5之间。 4.一种权利要求3所述的降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，其特征在于：播种前，用筛子将沙筛出，打畦，畦宽1.6-1.7m，每畦4行点播，播3-4粒种，距离10-12cm，播种深度3.0-4.0cm。 5.一种权利要求4所述的降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，其特征在于：在步骤(3)中，播种后，选取铺地膜或扣拱棚保温保湿，选温和天气去膜。 6.一种权利要求5所述的降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，其特征在于：在步骤(3)中，田间管理的过程中可喷布36％甲基硫菌灵悬浮剂500倍液。 7.一种权利要求6所述的降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，其特征在于：苹果病毒为ASGV、ACLSV、ASPV、ASSVd。 8.一种权利要求7所述的降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，其特征在于：苹果病毒检测采用RT-PCR技术，以cDNA为模板，在Taq酶的催化下，使用正反引物进行双链DNA的扩增。

技术领域

本发明属于果树脱毒种苗繁育技术领域，特别涉及一种降低八棱海棠种子病毒带毒率提 高发芽率的方法。

背景技术

苹果是我国的主栽果树之一，其栽培面积和总产量均居世界首位，但单产低、品质差， 与其地位极不相符，病毒病的危害是导致该现象的重要原因之一。苹果病毒病不仅严重影响 了果树的生长，降低了果实产量和品质以及果品贮藏性和耐运力，而且影响根系对土壤营养 物质的吸收和利用，对苹果生产危害很大，培育无毒苗木是目前防治苹果病毒病的唯一有效 措施。

砧木是果树生长的基础，对控制树势，增强果树抗逆性及抗病能力，扩大果树的适生范 围具有重要意义。现在我国生产上普遍应用的苹果苗木均以实生苗为基砧，其作为果树生产 的基础，能够直接影响接穗的生长和结果。目前苹果生产中应用较多的苹果砧木有山定子、 西府海棠、湖北海棠、楸子、新疆野苹果等。八棱海棠又名怀来海棠树，属蔷薇科，仁果亚 科，苹果属，属于楸子的一种。八棱海棠砧木具有树体强健，根系发达、须根较多、抗寒、 抗旱、抗涝、抗盐碱、抗病虫、耐瘠薄、适应性广，无论平地、山坡、丘陵、砂荒均能栽植。 在我国山东、河北、河南等地苹果苗木繁育应用非常广泛。

无毒苗木的生产主要通过脱毒的品种和中间砧与实生苗嫁接完成，这种生产方式的前提 是保证实生苗不带病毒。长期以来，人们普遍认为果树砧木实生苗不携带病毒或带毒率很低， 但是，现有的研究结果表明，苹果潜隐性病毒可以通过汁液、工具的交叉以及地下根系的交 接长合进行传播；苹果茎沟病毒可以通过种子传播，染病母株的后代群体平均带毒率为 5.98％。，苹果锈果类病毒除通过修剪工具进行传播外，也可通过种子传播，其中种子传毒率 为7.7％。

作为无毒苗木的基砧，应用八棱海棠育苗,需要将种子进行低温层积后播种。现有的研 究表明，八棱海棠种子主要携带苹果茎沟病毒和苹果锈果类病毒2种病毒，苹果茎沟病毒侵 染率为3.3％，苹果锈果类病毒带毒率为26.7％，复合侵染率3.3％，总体带毒率达到26.7％， 由于苗木生产中不可能对每株实生苗进行检测，严重影响了我国无病毒苗木的繁育。同时， 八棱海棠种子出苗率比较低，一般仅10％左右，严重增加了苹果育苗的生产成本。

发明内容

为了解决以上现有技术中八棱海棠种子苹果病毒病带毒率高，出苗率低，生产成本高的 问题，本发明提供了一种对八棱海棠种子病毒病脱除效果好，植株出苗率高，长势好的方法。

本发明提供一种降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，其特征在于：采用 1％高锰酸钾水溶液浸泡八棱海棠种子，进行沙藏、播种、获取无病毒苗木繁育的基砧。

本发明包括以下步骤：

(1)种子采集：在健康、无病害的树上，采收果实成熟后的八棱海棠种子；将果实环状 切开，取出种子用清水清洗2遍，去除果肉和种子表面的果胶，阴干后，放干燥通风处保存；

(2)高锰酸钾处理：在1月上旬，将种子放入1％高锰酸钾水溶液浸泡30分钟，用自来 水冲洗2次，晾干后，放置在背阴处沙藏；

(3)播种：在3月中下旬，在平均气温5-7℃时开始播种；播种量1.5-2.0Kg/666.7m2。 播种后，待苗长至2-3片真叶时，开始浇水，进行正常田间管理；

(4)实生苗优选与病毒抽检：待苗高8-10cm时，对苗圃中生长势弱、发育不正常、有 明显病害的实生海棠苗及时去除，同时疏除生长过密的苗木，保持通风，株距保持在 10-15cm；8月中下旬，对海棠苗木进行随机选取幼叶进行苹果病毒检测；抽检完毕后，所 得砧木即可作为苹果无病毒苗木繁育的基砧。

进一步地，在步骤(2)的沙藏中，种子与沙的比例在1：3-1：5之间。

进一步地，播种前，用筛子将沙筛出，打畦，畦宽1.6-1.7m，每畦4行点播，播3-4 粒种，距离10-12cm，播种深度3.0-4.0cm。

进一步地，在步骤(3)中，播种后，选取铺地膜或扣拱棚保温保湿，选温和天气去膜。

进一步地，在步骤(3)中，田间管理的过程中可喷布36％甲基硫菌灵悬浮剂500倍液。

进一步地，苹果病毒为ASGV、ACLSV、ASPV、ASSVd。

进一步地，苹果病毒检测采用RT-PCR技术，以cDNA为模板，在Taq酶的催化下，使用 正反引物进行双链DNA的扩增。

本发明的有益效果：

使用本发明的技术方法，八棱海棠种子出苗率达到47.6％，病毒脱除率达到95％，节省 育苗用海棠种子50％，大大节约了生产成本。

附图说明

图1是本发明提供的方法流程图。

具体实施方式

为了更好的理解本发明，下面结合附图与具体实施例来进一步说明。本发明以八棱海 棠实生种子为试验材料，采用0.1％KMnO4处理种子后沙藏，提高了出苗率，降低了实生种 子播种量一半以上，降低了实生砧木苹果病毒病带毒率。该方法是选择健康的母本树采集果 实，取种；1月上旬，用0.1％的KMnO4浸种30分钟后，用清水冲洗2遍，晾干后与3-5 倍体积的沙拌匀，于室外背阴处放置。3月下旬点播，距离10-12cm，播种深度3.0-4.0cm， 播种量1.5-2.0Kg/666.7m2。待苗高8-10cm时，对苗圃中实生苗选优，及时去除生长势弱、 发育不正常、有明显病害的实生海棠苗，疏除生长过密的苗木，保持通风，株距保持在 10-15cm左右。8月中下旬，随机采集实生苗幼叶进行病毒抽检。

实施例1：

本实施例降低八棱海棠种子病毒带毒率提高发芽率的方法，含有以下4个步骤：

(1)种子采集：对八棱海棠种子的采摘需确保果树的健康、无病害，待果实充分成熟 后采收。采收后，将果实已环状方式切开，将种子剔出，在剔出种子的过程中确保不要伤及 种皮。将取出的种子用清水清洗2遍，搓去果肉和种子表面的果胶，阴干后，放干燥通风处 保存。

(2)高锰酸钾处理：在1月上旬，配制1％高锰酸钾水溶液，将种子放入1％高锰酸钾 水溶液浸泡30分钟后，取出种子，用自来水冲洗2次，晾干。将晾干后的种子进行拌沙， 采用种子：沙＝1：3-1：5的配比进行拌制:，并放置在背阴处沙藏。

(3)播种：3月中下旬，待平均气温达到5-7℃时开始播种。播种前，用筛子将沙筛 出，打畦，畦宽1.6-1.7m，浇底水，待水渗下后，每畦4行点播，播3-4粒种，距离10-12cm， 播种深度3.0-4.0cm，后用耙子耙平整。播种量1.5-2.0Kg/666.7m2。播种后，注意保温保 湿。待苗长至2-3片真叶出现时，开始浇水，进行正常田间管理。播种后铺地膜或扣拱棚保 温保湿，选温和天气去膜，注意去除杂草，注意防治立枯病，在田间管理中可喷布36％甲基 硫菌灵悬浮剂500倍液。

(4)实生苗优选与病毒抽检：待苗高至8-10cm时，对苗圃中生长势弱、发育不正常、 有明显病害的实生海棠苗及时去除，同时疏除生长过密的苗木，保持通风，一般株距在 10-15cm左右。8月中下旬，对海棠苗木进行随机选取100株采集幼叶进行4种苹果病毒检 测。抽检完毕后，所得砧木即可作为苹果无病毒苗木繁育的基砧。

采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒的液氮研磨法提取嫩叶的RNA；采用 Thermo反转录试剂盒进行RNA反转录。

病毒检测所用引物见表1，均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1病毒检测引物序列

4种病毒的检测采用RT-PCR技术，以cDNA为模板，在Taq酶的催化下，使用正反引 物进行双链DNA的扩增。4种病毒的PCR反应条件分别为ASGV：94℃45s，58.6℃45s， 72℃1min；ACLSV：94℃45s，59℃45s，72℃1min；ASPV：94℃45s，54.4℃45s， 72℃1min；ASSVd：94℃45s，58℃45s，72℃1min；均循环35次，最后72℃延伸10min。 检测结果统计，带毒率(％)＝(检出病毒苗木树/抽检苗木总数)×100％。

对照组1

与实施例1相比，除操作步骤(2)中采取1月上旬，直接将种子拌沙后，置于背阴处 沙藏。其余(1)、(3)、(4)操作步骤与实施例1完全相同。

对照组2

与实施例1相比，操作步骤(2)中采取配置10％Na3PO4，浸种30分钟，用自来水冲洗2 次，晾干。拌沙后，于背阴处沙藏。其余(1)、(3)、(4)操作步骤与实施例1完全相同。

对照组3

与实施例1相比，操作步骤(2)中采取配置2％NaOH，浸种30分钟，用自来水冲洗2 次，晾干。拌沙后，于背阴处沙藏。其余(1)、(3)、(4)操作步骤与实施例1完全相同。 效果基础试验

实验材料：八棱海棠实生砧木种子。

试验处理：试验设4个处理组，每个处理组300粒，重复3次。

T1处理组使用实施例1处理方法；

T2处理组使用对照组1处理方法；

T3处理组使用对照组2处理方法；

T4处理组使用对照组3处理方法；

1、不同处理对八棱海棠种子发芽率和出苗率的影响

与对照(T2)相比较，2％NaOH(T4)、10％Na3PO4(T3)和1％KMnO4(T1)均能不 同程度的提高八棱海棠种子的发芽率和出苗率。以1％KMnO4处理30分钟的种子发芽率和 出苗率均最高，分别达到25.6％和45.7％。其次为10％Na3PO4处理30分钟，种子发芽率和 出苗率分别达到24.3％和40.0％。以2％NaOH处理的发芽率最低，仅为12.5％，低于常规处 理。

表1、不同处理对八棱海棠种子发芽率和出苗率的影响

处理 播种种子粒数 发芽率(％) 出苗率(％) T1(1％KMnO4) 300 25.6 45.7 T2(常规处理) 300 14.8 21.0 T3(10％Na3PO4) 300 24.3 40.0 T4(2％NaOH) 300 12.5 30.7

2、不同苹果砧木实生苗的带毒情况

5种苹果砧木实生苗的病毒检测结果表明，八棱海棠实生苗总体带毒率为26.7％，其中， 苹果茎沟病毒侵染率为3.3％，苹果锈果类病毒侵染率为26.7％，2种病毒复合侵染率为3.3％， 苹果褪绿叶斑病毒和苹果茎痘病毒未检出；福山沙果、平邑甜茶和山定子虽然只检测出苹果 锈果类病毒，但福山沙果和平邑甜茶的感染率均高达100％，山定子锈果类病毒携带率也达 到30％；楸子同时被苹果褪绿叶斑病毒、苹果茎痘病毒和苹果锈果类病毒3种病毒复合侵 染，复合侵染率达到53.3％，其中，苹果褪绿叶斑病毒的侵染率为43.3％，苹果茎痘病毒侵 染率达70％，苹果锈果类病毒为23.3％，该砧木总体带毒率高达73.3％(表2)。

表2苹果砧木实生苗的带毒率

3、不同处理对苹果病毒脱除效果

不同脱毒处理对苹果病毒病脱除效果不同。与常规处理(T2)相比，以2％NaOH(T4)、 和1％KMnO4(T1)T1和T4处理对苹果病毒脱除效果最好，脱除率达到100％，其次为 10％Na3PO4(T3)，常规处理的带毒率最高。

表3不同处理对苹果病毒脱除效果

处理 ASGV(％) ASPV(％) ACLSV(％) ASSVd(％) T1 0 0 0 0 T2 3.3 0 0 26.7 T3 2.5 0 0 12.5 T4 0 0 0 0

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离 本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一 点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求 而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括 在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式包含一个 独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书 作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的 其他实施方式。

本文标签： 发芽率海棠种子病毒方法