从野棉花叶中提取酵母菌抑制剂的方法

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本发明涉及一种从野棉花干叶中提取酵母菌抑制剂的方法，属于中草药活性成分的提取领域。该方法的工艺步骤如下：A、将野棉花的干叶粉碎后加入乙醇，室温下震荡分离出上清液，再将上清液浓缩干燥得乙醇浸膏；B、将乙醇浸膏分散于蒸馏水中，再加入己烷震荡萃取3～4次，收集水相萃取物；C、将水相萃取物浓缩后，上MCI-GEL反相树脂层析柱，用水-甲醇梯度洗脱，收集具有活性的甲醇洗脱峰流份，经浓缩干燥后即得到酵母菌抑制剂。本发明工艺简单、操作方便，环保，成本低；所提取得到的酵母抑菌剂的抑菌活性强、纯度高；浓度为10mg/ml时对酵母菌的抑菌圈直径为14～16mm。

1.一种从野棉花叶中提取酵母菌抑制剂的方法，其特征在于工艺步骤如下：A、将野棉花的干叶粉碎，于容器中按料液比1g：40~50ml加入乙醇，在室温下震荡36~40小时后，分离出上清液，再将上清液于50℃浓缩干燥30~50min，得乙醇浸膏；B、先将步骤A的乙醇浸膏分散于蒸馏水中，料水比为1g：20~30ml，再加入与蒸馏水等体积的正己烷震荡萃取3~4次，收集水相萃取物； C、将步骤B的水相萃取物浓缩到20~25ml后，上MCI-GEL反相树脂层析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脱，洗脱流速为1ml/min，收集具有活性的100wt%甲醇洗脱峰流份，于50℃浓缩干燥30~50min后即得到酵母菌抑制剂。 2. 根据权利要求1所述从野棉花叶中提取酵母菌抑制剂的方法，其特征在于步骤A所述粉碎的野棉花干叶的平均粒度为200~300μm。 3. 根据权利要求1所述从野棉花叶中提取酵母菌抑制剂的方法，其特征在于步骤A所述乙醇浸膏的收率为20~25%。 4.根据权利要求1所述从野棉花叶中提取酵母菌抑制剂的方法，其特征在于步骤C所述酵母菌抑制剂的收率为8~15%。

技术领域

本发明涉及一种酵母菌抑制剂的提取方法，特别是涉及一种从野棉花干叶中提取酵母菌抑制剂的方法，属于中草药活性成分的提取领域。

背景技术

食品腐败微生物会引起食品发生化学或物理性质变化，从而使食品失去原有的营养价值、组织性状及色、香、味。植物性和动物性食品原料在收获、运输、加工和贮藏过程中，都会受到微生物的污染。在能引起食品腐败变质的微生物中，起主要作用的，除了我们熟知的一些细菌和霉菌外，酵母菌也扮演着非常重要的角色。

在高浓度糖分的糖浆、果酱、浓缩果汁等食品中，使其变质起主要作用的有鲁氏酵母、罗氏酵母、蜂蜜酵母、意大利酵母、异常汉逊氏酵母、汉氏德巴利氏酵母、膜醭毕赤氏酵母等。其中罗氏酵母和汉氏德巴利氏酵母还具有较强的耐盐性，因此又称为耐盐性酵母。酵母菌对多数糖有分解作用，部分菌种还能氧化有机酸，具有耐高浓度糖和盐的特性，通常在果汁、炼乳中引起腐败。如炼乳球拟酵母、球拟酵母使炼乳罐头产气而膨胀，严重时发生爆裂。它们在果汁、果酱中繁殖后，改变内容物的风味，并产生汁液浑浊和沉淀，当大量产一氧化碳后，使容器膨胀和爆裂。而假丝酵母属是引起充气或不充气软饮料产生浑浊的腐败菌之一。其中，啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是常见的酵母菌，细胞呈圆形或椭圆性，有的有假丝，主要分布在果皮、果汁、果园土壤中。啤酒酵母是面包生产和酒精发酵最重要的属，同时也引起食品的腐败，产生酒精和二氧化碳。由此可见，酵母菌对食品腐败的作用不可小视。

目前，人们在生产应用中，为了防止酵母菌对食品的破坏作用，通常把一些抗生素，如链霉素、放线菌酮、制霉菌素等作为酵母菌抑制剂添加到食品中。很显然，如果人体长时间过量食用抗生素，肯定对身体造成巨大伤害。山梨酸是国际粮农组织和卫生组织推荐的高效安全的防腐保鲜剂，但是对酵母菌的抑制作用有限，在实际生产过程中必须添加很多的山梨酸，才能真正达到预期的效果，经济上不是很划算。因此，开发更多廉价、有效、作用更少的酵母菌抑制剂供食品工业选择使用就显得尤为重要。

我国中药资源丰富，从天然植物中寻找新的低毒、高效的酵母菌抑制剂一直是国内外的研究热点。野棉花（Anemone vitifolia），又叫打破碗花花，为毛莨科银莲花属植物。野棉花在生产应用上主要用于杀虫，具有土农药的美称，在四川、湖南等地野棉花被广泛应用于杀灭蛆虫和孑孓。野棉花中的活性成分主要为原白头翁素，具有抗小麦赤霉病和水稻白叶枯病的功能。然而，通过本发明实验研究还发现，野棉花的乙醇抽提物对酵母菌等真菌具有抑制活性，且活性成分稳定，与原白头翁素不同，易于制备与保存。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从野棉花叶中提取酵母菌抑制剂的方法。该方法工艺简单、操作方便，所提取得到的酵母抑菌剂抑菌活性强、纯度高。

本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的：

 一种从野棉花叶中提取酵母菌抑制剂的方法，其特征在于工艺步骤如下：

A、将野棉花的干叶粉碎，于容器中按料液比1g：40~50ml加入乙醇，在室温下震荡36~40小时后，分离出上清液，再将上清液于50℃浓缩干燥30~50min，得乙醇浸膏；

B、先将步骤A的乙醇浸膏分散于蒸馏水中，料水比为1g：20~30ml，再加入与蒸馏水等体积的正己烷震荡萃取3~4次，收集水相萃取物；

 C、将步骤B的水相萃取物浓缩到20~25ml后，上MCI-GEL反相树脂层析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脱，洗脱流速为1ml/min，收集具有活性的100wt%甲醇洗脱峰流份，于50℃浓缩干燥30~50min后即得到酵母菌抑制剂。

步骤A所述粉碎的野棉花干叶的平均粒度为200~300μm。

步骤A所述乙醇浸膏的收率为20~25%。

步骤C所述酵母菌抑制剂的收率为8~15%。

本发明制备得到的酵母抑制剂通过下述方法进行的性能测试显示：

将具有活性的洗脱峰流份以0.2mm的薄层硅胶板进行展开，展开剂为氯仿：甲醇=7ml:3 ml。用5wt%的硫酸喷雾后加热显色，具有最高活性洗脱峰的Rf值为0.5~0.6。

本发明突出的技术效果表现在：

（1）整个工艺过程简单、操作方便，先以乙醇提取野棉花，所得浸膏再以水、正己烷震荡提取，最后再经MCI-GEL反相树脂层析柱，按规定浓度的水-甲醇作梯度洗脱得到酵母菌抑制剂。在整个提取分离过程中除使用到乙醇及低毒的正己烷外，未涉及其他有毒溶剂，环保，成本低；

（2）按本发明方法及所设定的工艺参数从野棉花中提取的酵母菌抑制剂，其抑菌活性强、纯度高。实验证明，在浓度为10mg/ml（2mg/dic）时，对酵母菌的抑菌圈直径为14~16mm。

具体实施方式

    下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是本实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制。

实施例1：

A、将10g野棉花的干叶粉碎，平均粒度为200μm，于容器中加入400ml乙醇，在室温下震荡36小时，分离出上清液，再将上清液于50℃浓缩干燥30min，得乙醇浸膏2.1g，收率为21%。

B、将步骤A的乙醇浸膏分散于50ml蒸馏水中，然后用50ml正己烷震荡萃取3次，收集水相萃取物。

C、将步骤B的水相萃取物浓缩到20ml后，上MCI-GEL反相树脂层析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脱，洗脱流速为1ml/min，收集具有活性的100wt%甲醇洗脱峰流份，于50℃浓缩干燥30min后即得到白色固体状的酵母菌抑制剂0.17g，收率为8.3%。

实施例2：

A、将10g野棉花的干叶粉碎，平均粒度为250μm，于容器中加入450ml乙醇，在室温下震荡38小时，分离出上清液，再将上清液于50℃浓缩干燥40min，得乙醇浸膏2.48g，收率为24.8%。

B、将步骤A的乙醇浸膏分散于60ml蒸馏水中，然后用60ml正己烷震荡萃取4次，收集水相萃取物。

C、将步骤B的水相萃取物浓缩到25ml后，上MCI-GEL反相树脂层析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脱，洗脱流速为1ml/min，收集具有活性的100wt%甲醇洗脱峰流份，于50℃浓缩干燥50min后即得到白色固体状的酵母菌抑制剂0.3g，收率为12.1%。

实施例3：

A、将10g野棉花的干叶粉碎，平均粒度为300μm，于容器中加入500ml，在室温下震荡40小时，分离出上清液，再将上清液于50℃浓缩干燥50min，得乙醇浸膏2.3g，收率为23%。

B、将步骤A的乙醇浸膏分散于55ml蒸馏水中，然后用55ml正己烷震荡萃取3次，收集水相萃取物。

C、将步骤B的水相萃取物浓缩到23ml后，上MCI-GEL反相树脂层析柱，用水-甲醇依次按20wt%、60wt%、100wt%作梯度洗脱，洗脱流速为1ml/min，收集具有活性的100wt%甲醇洗脱峰流份，于50℃浓缩干燥40min后即得到白色固体状的酵母菌抑制剂0.34g，收率为14.7%。

 实施例4：抗菌活性试验

以上述实施例1-3提取得到的酵母菌抑制剂为例，其抗菌活性试验方法及结果如下：

1）供试菌株包括：大肠杆菌( Escherichia coli ATCC 25922)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC 14028)，金黄色葡萄球菌(Staphylpcoccus aureus ATCC 25923)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis ATCC 21216)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus ATCC 10231)，侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus ATCC 64)，黄曲霉（Aspergillus flavus ATCC  204304），黑曲霉（Aspergillus niger ATCC 16404），根霉（Rhizopus oryzae  ATCC 9363），青霉（Pencicillium citrinum ATCC 14994），白色念珠菌(Candida albicans  ATCC 10231)，啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763）。本实验中的实验菌株由四川大学食品科学与技术四川省重点实验室提供。

2）细菌固体培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，其主要组成成分如下：

牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.5g，琼脂2g，水100ml，灭菌前用浓度2M NaOH调pH值为7.2~7.4。真菌及酵母培养基为土豆培养基，其主要组成成分如下：去皮后的马铃薯200g，蔗糖20g，水1000mL，琼脂20g。

3）抗菌活性测定采用牛津杯法。牛津杯在121℃条件下高压灭菌 20min，冷却干燥备用；将受试物用95%甲醇溶液稀释成10mg/ml溶液并用 0.22μm细菌滤器过滤除菌备用；将牛津杯放置于已冷却的含菌双碟平板表面，吸取 200μl 的受试物稀释液分别注入牛津杯中，然后放入 37℃培养 36h ，观察各平板抑菌圈直径大小。每组4个平板，每个平板放置2个牛津杯，重复3次，用游标卡尺测定并记录结果，抑菌圈直径取平均值。

4）测试结果如表1所示：

表1   实施例1-3提取物抗菌活性结果

 a 实验浓度为10mg/ml，每个平板注入200μl，每个平板含提取物2 mg。

b 用95%甲醇溶解提取物，故采用95%甲醇做阴性对照。

c 10mg/ml 青霉素和链霉素分别作为细菌、霉菌及酵母的阳性对照。

    由上表可以看出，野棉花提取物对细菌没有影响；真菌中除对黑曲霉有抑制作用外，其它几种真菌没有影响；对酵母菌的抑菌效果和链霉素差不多。因此，该野棉花提取物可以作为理想的酵母菌抑制剂。

本文标签： 酵母菌抑制剂棉花方法