一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法

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本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法。包括：1、获得无菌外植体；2、获取能够快速形成胚性愈伤组织的培养基；3、获得状态良好的胚性细胞；4、获得白刺花体细胞胚发生培养基；5、体细胞胚成熟培养；6、体细胞胚萌发及生根培养。该发明通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株，有效避免行常规种子繁殖性状易分离，萌发率低，出苗不整齐等问题，通过胚性愈伤组织诱导、增殖培养，体细胞胚发生、成熟、萌发及生根等过程，避免了污染、褐化、玻璃化及畸形胚。

1.一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法，包括以下步骤：步骤一获得无菌外植体，将健康饱满无损害的白刺花种子划破种皮，用70%的酒精消毒30s后、转入0.1%的HgCl溶液中消毒12min，无菌水冲洗5-6次吸干水分后接种于不添加任何激素MS+3%蔗糖+0.7%琼脂的培养基上，在温度为25℃、10mmol·m·s的弱光下培养14d后取下胚轴作为外植体；步骤二获取能够快速形成胚性愈伤组织的培养基，将无菌下胚轴切成0.5cm-1.0cm大小，平放于诱导培养基上，诱导培养基以MS为基本培养基，蔗糖浓度为40g·L，琼脂为7.0g·L，pH5.8，生长调节剂组合试验设计采用正交设计，四因子四水平16次试验，接种后先暗培养10d，然后转到20mmol·m·s光照下培养，光照时数为14h·d，培养温度25±1℃；培养45d后，形成胚性愈伤组织，统计愈伤组织和胚性愈伤组织的形成情况，利用改良苯酚品红染液显微镜下观察胚性细胞及非胚性细胞形态；步骤三获得状态良好的胚性细胞，将胚性愈伤组织分别接种于MS培养基，MS培养基参数为0.5mg/LTDZ、0.5mg/L6-BA、2,4-D、40g/L蔗糖、100mg/L谷氨酰胺、7g/L琼脂、pH5.8、2,4-D浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5mg/L，光照强度为10mmol/m·s，白天14h/黑暗10h，25d左右继代一次，共继代2次；步骤四获得白刺花体细胞胚发生培养基，包括：①将状态良好的胚性愈伤组织接种于不同生长调节剂组合：NAA0-0.5mg/L、6-BA0-1.0mg/L和TDZ0-0.5mg/L的体细胞胚发生培养基上，蔗糖浓度为40g·L，琼脂为7.0g·L，谷氨酰胺100mg·L，pH5.8，每瓶接种胚性愈伤组织3-5块，每个处理3次重复，20mmol·m·s的光下培养，光照时数为14h·d，温度25±1℃；②将状态良好的胚性愈伤组织接种于不同氮素水平的MS培养基上，培养基中KNO和NHNO的比例分别为+KNO和-NHNO，+2KNO和-NHNO，+2KNO,和+1/2NHNO，+KNO和+1/2NHNO，-KNO和+2NHNO，-KNO和+NHNO，其余参数NAA0.5mg·L+6-BA1.0mg·L+TDZ0.5mg·L+蔗糖40g·L+谷氨酰胺100mg·L+琼脂7.0g·L，20mmol·m·s的光下培养，光照时数为14h·d，温度25±1℃；③将状态良好的胚性愈伤组织转接到体细胞胚发生的分化培养基上，MS(+2KNO,+1/2NHNO)为基本培养基,NAA0.5mg·L+6-BA1.0mg·L+TDZ0.5mg·L+蔗糖40g·L+谷氨酰胺100mg·L+琼脂7.0g·L，ABA分别为0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg·L，蔗糖4%，谷氨酰胺100mg·L，琼脂0.7%，pH5.8，20mmol·m·s光下培养，光照14h·d，温度25℃；④将状态良好的胚性愈伤组织转接到体细胞胚发生的分化培养基上，MS(+2KNO,+1/2NHNO)为基本培养基，NAA0.5mg·L+6-BA1.0mg·L+TDZ0.5mg·L+蔗糖40g·L+谷氨酰胺100mg·L+琼脂7.0g·L，PEG-6000分别为0、5、10、20、30、40、50、80、100g·L，蔗糖浓度分别为10、20、30、40、50、80、100g·L，肌醇0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，15.0，18.020.0g·L，20mmol·m·s光下培养，光照14h·d，温度25℃；步骤五体细胞胚成熟培养，将白刺花体细胞胚分化培养得到的球形胚接种于体细胞胚成熟培养基上，成熟培养基比较蔗糖、麦芽糖、山梨醇和PEG不同浓度及组合：蔗糖2%、3%、4%、5%、6%、7%，麦芽糖2%、5%、7%与蔗糖4%组合，山梨醇2%、5%、7%与蔗糖4%组合，麦芽糖2%与山梨醇2%和蔗糖4%组合，PEG-6000为20、30、40、50、60、70g·L，ABA15g·L，NAA1.0mg·L，6-BA2.0mg·L，TDZ1.0mg·L，谷氨酰胺100mg·L，植物凝胶3g·L，活性炭2g·L，20mmol·m·s的光下培养，光照14h·d，温度25±1℃；步骤六体细胞胚萌发及生根培养，挑取肉眼可见的已发育至球形期的体细胞胚分别接种于体胚萌发培养基上，培养基为改良MS培养基：大量元素用量分别为1/5、1/4、1/3、1/2和MS，NAA0.2mg·L＋6-BA0.1mg·L＋活性炭0.2%＋蔗糖25g·L＋琼脂7g·L，pH5.8,30mmol·m·s光照下培养，获得完整幼苗。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法。

背景技术

白刺花(Sophora davidii)又名苦刺花，白花刺，苦豆刺，铁马胡烧，狼牙刺，马蹄针等，为豆科槐属多年生落叶小灌木。在我国华北、陕西、甘肃、河南、江苏、浙江、湖北、湖南、广西、四川、贵州、云南、西藏等地均有分布。白刺花根系强大，具有较强的抗旱能力，可作水土保持的先锋树种；其小花数多且密集，是优良的蜜源植物；花、根、叶和种子可入药，具有清热利咽、消热解暑和凉血消肿等作用，可治肺热咳嗽、咽喉肿痛、痢疾、腹痛、便血及抑瘤等病症；白刺花多生长于天然环境中，尚未受到农药、化肥等的污染，是天然无公害“绿色食品”，白刺花行种子繁殖，虽结实量大，但种子硬实，具有一定的休眠性，自然状态下幼苗少，出苗不整齐，种群更新漫，限制幼苗生长及定居，极大的限制了育苗造林及开发利用。

植物体细胞胚再生方式由于来源于单个的原始胚性细胞，遗传相对稳定，繁殖系数高、可作为外源基因转化受体等特点，因此已成为遗传改良、快速繁育和商品化生产种苗的重要途径。最早的植物体细胞胚发生成功的报道来自于Steward和Reinert对胡萝卜根的培养，之后一段时期内体细胞胚的研究成果多来自于草本植物，而在木本植物研究方面，最早的研究工作始于Rao对檀香（Santalum album Linn．）组培研究中发现体细胞胚结构,但未获得再生植株, 直到Gupta等首次报道挪威云杉体细胞胚胎发生成功以来, 世界范围内，已通过体细胞胚发生途径诱导并培育出180余种木本植物再生植株。如花旗松(Pseudotsuga menziesii)、火炬松(Pinus taeda)、辐射松(Pinus radiata)、挪威云杉(Picea abies)、水曲柳（Fraxinus mandshurica）、杂交鹅掌楸（Liriodendron hybrids）这些植物通过体细胞胚诱导的再生植株已成功应用于生产实践。而有关通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法，尚未见报道。

发明内容

本发明的目的旨在提供一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法，为白刺花优质种苗的快速繁殖提供技术平台。

一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法，包括：1、双重表面杀菌，获得无菌外植体；2、通过正交设计四种生长调节剂组合，获取能够快速形成胚性愈伤组织的培养基；3、以2,4-D为调节剂，获得状态良好的胚性细胞；4、通过不同生长调节剂、KNO3和NH4NO3的比例、ABA、渗透剂的比较，获得白刺花体细胞胚发生培养基；5、通过蔗糖、麦芽糖、山梨醇和PEG不同渗透剂组合, 获得体细胞胚成熟和萌发最佳的培养基；6、成熟体细胞胚生根培养，最终获得健康的再生植株。

本发明的有益效果：1、双重表面杀菌获得无菌的外植体，有效降低了污染。2、采用正交设计四种生长调节剂组合，获得了胚性愈伤组织最佳的诱导培养基，3、胚性愈伤组织状态调整及保持，有效提高了体细胞胚发生率； 4、通过生长调节剂、氮素、ABA、渗透剂不同因子的比较，获得白刺花体细胞胚发生培养基，有效提高了体细胞胚发生率、体细胞胚质量和数目；5、不同渗透剂组合有效提高体细胞胚成熟、萌发和减少畸形胚比例。

具体实施方式

一种通过体细胞胚发生途径获得白刺花再生植株的方法，包括以下步骤。

步骤一 获得无菌外植体：将健康饱满无损害的白刺花种子划破种皮，用70%的酒精消毒30s后、转入0.1%的HgCl2溶液中消毒12min，无菌水冲洗5-6次吸干水分后接种于不添加任何激素MS+3%蔗糖+0.7%琼脂的培养基上，在温度为25℃、10mmol·m-2·s-1的弱光下培养14d后取下胚轴作为外植体。

步骤二 获取能够快速形成胚性愈伤组织的培养基：将无菌下胚轴切成0.5 cm -1.0cm大小，平放于诱导培养基上，诱导培养基以MS为基本培养基，蔗糖浓度为40 g·L-1，琼脂为7.0 g·L-1，pH 5.8，生长调节剂组合试验设计采用正交设计，四因子四水平16次试验，每瓶接种外植体6块，每个处理组合3次重复，接种后先暗培养10 d，然后转到20 mmol·m-2·s-1光照下培养，光照时数为14 h·d-1，培养温度25±1℃。培养45d后，形成胚性愈伤组织，统计愈伤组织和胚性愈伤组织的形成情况，利用改良苯酚品红染液显微镜下观察胚性细胞及非胚性细胞形态。

步骤三 获得状态良好的胚性细胞：将胚性愈伤组织分别接种于MS培养基，MS培养基参数为0.5 mg/L TDZ、0.5 mg/L 6-BA、2,4-D、40 g/L蔗糖、100 mg/L谷氨酰胺、7 g/L琼脂、pH 5.8、2,4-D浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mg/L，每处理接种25瓶，每5瓶为1重复，5次重复，光照强度为10 mmol/m2·s，白天14 h/黑暗10 h，25 d左右继代一次，共继代2次。

步骤四 获得白刺花体细胞胚发生培养基，包括：

①将状态良好的胚性愈伤组织接种于不同生长调节剂组合：NAA0-0.5 mg/L、6-BA 0-1.0 mg/L和TDZ 0-0.5 mg/L的体细胞胚发生培养基上，蔗糖浓度为40 g·L-1，琼脂为7.0 g·L-1，谷氨酰胺100 mg·L-1，pH 5.8，每瓶接种胚性愈伤组织3-5块，每个处理3次重复，20 mmol·m-2·s-1的光下培养，光照时数为14 h·d-1，温度25±1℃；

②将状态良好的胚性愈伤组织接种于不同氮素水平的MS培养基上，培养基中KNO3和NH4NO3的比例分别为+KNO3和-NH4NO3， +2KNO3和-NH4NO3， +2KNO3,和+1/2NH4NO3， +KNO3和+1/2NH4NO3， -KNO3和+2NH4NO3， -KNO3和+NH4NO3，其余参数NAA 0.5 mg·L-1 + 6-BA 1.0 mg·L-1 + TDZ 0.5 mg·L-1 + 蔗糖40 g·L-1 +谷氨酰胺100 mg·L-1 + 琼脂 7.0 g·L-1，每瓶接种胚性愈伤组织3-5块，每个处理3次重复，20 mmol·m-2·s-1的光下培养，光照时数为14 h·d-1，温度25±1℃；

③将状态良好的胚性愈伤组织转接到体细胞胚发生的分化培养基上，MSsalt(+2KNO3,+1/2NH4NO3)为基本培养基, NAA 0.5 mg·L-1 + 6-BA 1.0 mg·L-1 + TDZ 0.5 mg·L-1 + 蔗糖40 g·L-1 +谷氨酰胺100 mg·L-1 + 琼脂 7.0 g·L-1，ABA分别为0、1.0、5.0、10.0、15.0、20.0mg·L-1，蔗糖4%，谷氨酰胺100mg·L-1，琼脂0.7%，pH5.8，20 mmol·m-2·s-1光下培养，光照14h·d-1，温度25℃；

④将状态良好的胚性愈伤组织转接到体细胞胚发生的分化培养基上， MSsalt(+2KNO3,+1/2NH4NO3)为基本培养基，NAA 0.5 mg·L-1 + 6-BA 1.0 mg·L-1 + TDZ 0.5 mg·L-1 + 蔗糖40 g·L-1 +谷氨酰胺100 mg·L-1 + 琼脂 7.0 g·L-1，PEG-6000分别为0、5、10、20、30、40、50、80、100g·L-1，蔗糖浓度分别为10、20、30、40、50、80、100g·L-1，肌醇0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，15.0，18.0 20.0g·L-1，20 mmol·m-2·s-1光下培养，光照14h·d-1，温度25℃。

步骤五 体细胞胚成熟培养，将白刺花体细胞胚分化培养得到的球形胚接种于体细胞胚成熟培养基上，成熟培养基比较蔗糖、麦芽糖、山梨醇和PEG不同浓度及组合：蔗糖2%、3%、4%、5%、6%、7%，麦芽糖2%、5%、7%与蔗糖4%组合，山梨醇2%、5%、7%与蔗糖4%组合，麦芽糖2%与山梨醇2%和蔗糖4%组合，PEG-6000为20、30、40、50、60、70 g·L-1，ABA 15 g·L-1，NAA 1.0 mg·L-1， 6-BA 2.0 mg·L-1，TDZ 1.0 mg·L-1，谷氨酰胺100mg·L-1，植物凝胶3 g·L-1，活性炭2 g·L-1， 20 mmol·m-2·s-1的光下培养，光照14h·d-1，温度25±1℃。

步骤六 体细胞胚萌发及生根培养：挑取肉眼可见的已发育至球形期的体细胞胚分别接种于体胚萌发培养基上，培养基为改良MS培养基：大量元素用量分别为1/5、1/4、1/3、1/2和MS，NAA 0.2 mg·L-1 ＋ 6-BA 0.1 mg·L-1 ＋活性炭0.2%＋ 蔗糖25 g·L-1 ＋ 琼脂7 g·L-1，pH 5.8, 30 mmol·m-2·s-1光照下培养，每瓶接种3-5个球形胚，每个处理3次重复，直至获得完整幼苗后，将幼苗炼苗后移栽至装有基质的花盆中，30 d后统计植株成活率。

上述具体实施方式中白刺花下胚轴胚性愈伤组织诱导率为77.3%，2,4-D为0.5 mg/L时胚性愈伤组织的增殖量为2.29 g，增殖率为172.18%，获得了状态良好的胚性细胞； KNO3浓度提高一倍，NH4NO3降至一半，体细胞胚发生率可提高至91.33%，麦芽糖2%与山梨醇2%和蔗糖4%组合使用，体细胞胚成熟率高达88.89%，成熟体细胞胚生根培养时，生根率最高为87.47%，幼苗驯化移栽一个月后成活率达90%以上。

本文标签： 体细胞植株途径发生方法