一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法

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本发明涉及一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法，包括：准备实验用水、清洗、暂养、驯化、实验。本发明可以较为真实反映胁迫情况下缢蛏的耐受性能，具有操作简单、重复性高等优点；为双壳贝类的急性毒性实验提供了一个参考案例，也为缢蛏作为一种养殖新品种引入盐碱水养殖提供了科学依据。

1.一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法，包括：(1)用海水晶配制暂养水，盐度与取样点相同；将采集的缢蛏清洗，置于暂养水中进行暂养；(2)向暂养池中加入过滤后的自来水，使得盐度逐渐过渡至起始盐度与实验盐度差的中间值，即一级驯化；向暂养池中加入过滤后的自来水，使得盐度逐渐过渡至实验盐度，即二级驯化；(3)完成驯化后选择缢蛏，按照设置的实验梯度开展静态急性毒性实验，实验过程不投喂藻类，进行充氧；每天定时观测记录个体的死亡率，即可。 2.根据权利要求1所述的一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法，其特征在于：所述配制暂养水、暂养、一级驯化、二级驯化均需充氧曝气。 3.根据权利要求1所述的一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法，其特征在于：所述步骤(1)中的暂养时间为48小时。 4.根据权利要求1所述的一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法，其特征在于：所述步骤(2)中的一级驯化和二级驯化的时间均为24小时。 5.根据权利要求1所述的一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法，其特征在于：所述暂养和一级驯化时早晚各投喂一次蛋白核小球藻。 6.根据权利要求1所述的一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法，其特征在于：所述步骤(3)中的静态急性毒性实验时间为7天。

技术领域

本发明属于水生动物试验领域，特别涉及一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法。

背景技术

盐碱水是分布于陆地区域、矿化度大于1000mg·L-1小于50000mg·L-1的非海洋性咸水资源，我国盐碱地面积为1.49×109亩，低洼盐碱水约为6.9×108亩，广泛分布在我国东北、华北、西北内陆地区的19个省、市和自治区。盐碱水质具有高pH值、高碳酸盐碱度、高离子系数、水质类型繁多及主要离子比例失调等特点，由于人畜无法饮用，农业无法直接利用，绝大多数处于闲置状态。但是根据“盐碱随水而来，随水而去”的特点，建立“以渔降盐、以渔治碱”的利用模式，将盐碱水渔业利用引入盐碱地生态治理，可以有效拓展渔业发展空间、形成新的生产力，提高农民收入，符合国家经济发展与环境生态保护相协调的可持续发展战略。

我国是世界上最大的贝类养殖国，贝类年产量占世界贝类总产量的60％以上，贝类增养殖已经成为沿海海水养殖业的支柱之一。其中缢蛏是我国四大养殖贝类之一，其主要分布于我国的南北沿海滩涂。由于缢蛏摄食，消耗养殖水体中大量的有机碎屑和浮游生物，改善了水体富营养化现象。缢蛏作为一种广盐性贝类，经济价值和环境效益兼备，将其引用于盐碱水养殖前景光明。如何科学评价缢蛏对盐碱水质的适应性能，急性毒性实验是较为简单、快速的方法。

急性毒性是指毒物在短时间内能引起试验动物迅速产生严重的损伤。由于死亡容易观察，而且是最明显而又最严重的有害影响，因此进行水生动物试验时，常用死亡作为急性中毒的观察指标，常以引起试验动物死亡50％的浓度来度量急性毒性。采用水生生物急性毒性实验是考察水生生物抗逆性能的技术手段，但目前传统的水生生物试验方法，其毒性试验的程序设计及试验持续时间主要以鱼类作为研究对象，通常为96小时。贝类作为一种软体动物，由头、足、内脏囊、外套膜和斧足5部分组成，且有明显的避害闭壳行为，这种行为可以让贝类在一定程度上降低环境因子对其的影响，因此针对缢蛏该如何进行急性毒性实验仍然需要进一步的研究。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法，该方法为双壳贝类的急性毒性实验提供了一个参考案例，也为缢蛏作为一种养殖新品种引入盐碱水养殖提供了科学依据。

本发明提供了一种缢蛏盐碱水质适应性能评价的静态急性毒性实验方法，包括：

(1)用海水晶配制暂养水，盐度与取样点(即取缢蛏点)相同；将采集的缢蛏清洗，置于暂养水中进行暂养；

(2)向暂养池中加入过滤后的自来水，使得盐度逐渐过渡至起始盐度与实验盐度差的中间值，即一级驯化；向暂养池中加入过滤后的自来水，使得盐度逐渐过渡至实验盐度，即二级驯化；

(3)完成驯化后选择缢蛏，按照设置的实验梯度开展静态急性毒性实验，实验过程不投喂藻类，进行充氧；每天定时观测记录个体的死亡率，即可。

所述配制暂养水、暂养、一级驯化、二级驯化均需充氧曝气。

所述步骤(1)中的暂养时间为48小时。

所述步骤(2)中的一级驯化和二级驯化的时间均为24小时。

所述暂养和一级驯化时早晚各投喂一次蛋白核小球藻。

所述步骤(3)中的实验梯度包括盐度、碱度或温度等。

所述步骤(3)中的静态急性毒性实验时间为7天。

本发明就96小时急性毒性实验方法是否适用于缢蛏、试验前是否需要暂养驯化处理、试验期间是否需要喂食等进行了明确的界定。重要环节包括：1、试验时间，2、试验前是否需要暂养驯化；3、试验缢蛏的准备与挑选；4、试验期间是否需要喂食；5、死亡判定方法。

有益效果

本发明可以较为真实反映胁迫情况下缢蛏的耐受性能，具有操作简单、重复性高等优点；为双壳贝类的急性毒性实验提供了一个参考案例，也为缢蛏作为一种养殖新品种引入盐碱水养殖提供了科学依据。

附图说明

图1为未经驯化处理和驯化处理后的三组缢蛏死亡率对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1 缢蛏低盐度水质静态急性毒性实验

一、试验前是否需要暂养驯化

如图1所示，未经驯化处理的缢蛏直接投放到盐度为1‰的水中，第一天缢蛏就表现出明显的不适应，平均死亡率高达46.7±3.8％，而实验盐度同为1‰经过驯化处理的缢蛏，第一天的死亡率只有1.1±1.1％。未驯化组采用方差分析，盐度1‰和盐度3‰两个梯度的第1天平均死亡率与后6天有显著性差异(P<0.05)，说明在低盐度水体养殖缢蛏，应事先采取驯化措施降低低盐度水体对其影响。

表1 同一盐度不同处理方式螠蛏死亡率差异显著性分析

表1说明本实验做了盐度为1‰、3‰和5‰的三个浓度的缢蛏驯化和不驯化两种处理对比，配对样本T检验发现三组的死亡率均存在显著性差异。经试验表明盐度在5‰以下的水体养殖缢蛏或开展急性毒性实验，应预先采取分级低盐驯化措施，降低低盐度水体对其胁迫。

由此得出结论，应预先采取分级低盐驯化措施。

二、实验实施时间探索

(1)实验用水准备：在500L的塑料暂养池中用海水晶(品牌：blue-sea)和过滤的自来水配制盐度为15‰的暂养水300L，用折光仪(品牌：AS ONE,型号：IS-10E)对水体盐度进行粗校和用多参数水质监测仪(品牌：YSI,型号：professional plus)对盐度进行精确校核。池内充氧曝气48小时。在另一个500L的塑料暂养池加入过滤的自来水400L，同时进行充氧曝气，作为步骤(4)、(5)的分级稀释用水。

(2)清洗：用自来水将从蛏田采挖的缢蛏进行清洗，将死亡和残缺个体挑出。

(3)暂养：将清洗后，个体完整的缢蛏放入15‰盐度的暂养池中暂养48小时。早晚各投喂蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)一次，其间进行充氧曝气。根据水质及时换水、吸污,挑出死贝。

(4)一级驯化：向15‰盐度的暂养池中按2：1比例加入充氧曝气后的过滤自来水，使盐度降至10‰，驯化暂养时间为24小时，早晚各投喂一次蛋白核小球藻。其间进行充氧曝气。根据水质及时换水、吸污,挑出死贝。

(5)二级驯化：向步骤(4)的暂养池中按比例加入过滤后的自来水盐度降至5‰，驯化暂养时间为24小时，停止投喂藻类，其间进行充氧曝气。根据水质及时换水、吸污,挑出死贝。

(6)盐度急性毒性实验：暂养驯化后，选择活力好、健康、大小规格基本一致的缢蛏30个/框,随机分组实验。活力好的表现是观察到缢蛏有水管伸出，用手触碰它，水管迅速收回，闭壳。分别置于15L周转箱(规格：长42cm×宽30cm×高15.5cm)，并进行打样记录缢蛏的长度和重量(壳长：5.15±0.34cm，湿重：10.95±2.25g)。设置的盐度系列为0.5‰、1‰、2‰、3‰、4‰、5‰，周转箱内注入8L对应实验盐度的水，实验每组浓度设置三平行，实验过程不投喂藻类，进行充氧。每天定时观测记录缢蛏个体的死亡数目，以缢蛏水管伸出，壳张开，触碰不闭壳，水管不缩回作为判定为死亡的依据。盐度静态急性毒性实验时间为7天。

(7)试验结果及结论：

表2 缢蛏低盐度水体静态急性毒性实验结果

注：数据为死亡率平均值±标准误差

在低盐度水体进行缢蛏急性毒性实验，事先分级驯化后，选取盐度5‰为对照组，表2结果数据表明该组的死亡率在第9天出现显著上升，当对照组的死亡率上升时，继续开展急性毒性实验就失去了意义，而0.5‰和1‰两组盐度进行到第7天就全部死亡。单因素方差分析表明，0.5‰、1‰、2‰、3‰、4‰各盐度组死亡率均值开始出现显著性差异的天数对应为第4、4、6、7、8天；当实验进行到第15天，只有5‰、4‰组还有部分个体存活，但死亡率也超过50％。因此本发明认为低盐度水体进行缢蛏急性毒性实验，实施时间至少应为7天。

三、实验期间是否需要投喂探索

由于实验时间定为7天，远长于传统的水生生物急性毒性试验时间96小时。为确认7天不投喂是否会因为饥饿对缢蛏死亡率造成影响，本发明选取盐度为2‰的水体分别进行了投喂和不投喂的实验，实验操作同步骤(6)，投喂组早晚各投喂一次蛋白核小球藻。表3结果数据表明7天内不投喂组的死亡率在同等条件下均低于投喂组，且用配对样本T检验也验证两组数据存在显著性差异(P<0.05)。因此可以认为7天内不投喂开展缢蛏的急性毒性实验并不会因为饥饿对缢蛏死亡率造成影响。

表3 缢蛏低盐度水体是否投喂藻类毒性实验结果

注：数据为死亡率平均值±标准误差

因此，本发明认为对缢蛏进行盐碱水质耐受性能评价所开展的急性毒性实验，实施时间至少应为7天，全程充氧，试验期间无需投喂。

本文标签： 盐碱毒性水质静态性能