一种氨氮对萼花臂尾轮虫的毒性检测方法

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本发明公开了一种萼花臂尾轮虫的培养及氨氮对其毒性的检测方法，所述培养方法采用单胞藻和酵母混合饵料投食并添加微量元素，混合投喂并添加微量元素，具有使轮虫的增长速度快，生长状态好，出现死亡轮虫数量少的优点；本发明还包括一氨氮对萼花臂尾轮虫毒性的检测方法，通过若干个不同质量浓度梯度的氨氮微孔培养板进行培养，并观察随时间变化萼花臂尾轮虫体内的H2O2、丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）活性变化以及随时间变化的个体死亡数,以检测氨氮对萼花臂尾轮虫的急性毒性以及随时间变化的个体死亡数，采用测定萼花臂尾轮虫体内的H2O2、MDA含量和SOD活性变化能准确灵敏地检测氨氮对萼花臂尾轮虫急性毒性。

1.一种氨氮对萼花臂尾轮虫的毒性检测方法，包括一种萼花臂尾轮虫的培养方法，其特征在于，所述萼花臂尾轮虫培养方法采用单胞藻和酵母混合饵料投食并添加微量元素；所述投食的频率为1次/天，投食密度为2×10个/ml；所述微量元素添加量为：FeCHO5×10mol/L、CuSO3×10mol/L、CuSO8×10mol/L、MnSO3×10mol/L、CoCl4×10mol/L、NiSO5×10mol/L、NaMoO1×10mol/L；所述氨氮对萼花臂尾轮虫的毒性检测方法，包括如下步骤：1)分别设定7个不同氨氮质量浓度梯度的微孔培养板，且浓度梯度分别为1.5mg/L、2.5mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、20.0mg/L、25.0mg/L、30.0mg/L，用分析纯级NHCl配制，另设1个未添加氨氮的对照微孔培养板；2)用吸管随机吸取预培养的不带卵、个体较大、游动活跃的萼花臂尾轮虫，置于含不同氨氮浓度梯度的微孔培养板中，每孔含10个萼花臂尾轮虫个体和10mL试验溶液，盖上盖子以防水分蒸发；3)将微孔培养板在恒温培养箱中培养，pH为7.5±0.2，投食密度为4×10个/mL；4)在实验开始后的第6h、24h、48h、96h用解剖镜观察萼花臂尾轮虫的存活情况，及时挑出并记录个体死亡数；萼花臂尾轮虫培养24h后分别取样，萼花臂尾轮虫样品用生理盐水润洗、过滤，滤纸吸干水分，准确称量后，在冰冷的研钵中用质量体积1：9的匀浆介质制成组织匀浆，4℃下离心10min，离心条件为5000r/min，取上清液待用，测定萼花臂尾轮虫HO和MDA含量以及SOD、CAT酶活性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种氨氮对萼花臂尾轮虫的毒性检测方法。

背景技术

萼花臂尾轮虫是淡水中常见的一种轮虫，由于其在渔业生产上具有易于高密度培养、适应性强、种群增长迅速、适口性好、营养丰富等特点，因此被广泛用于鱼虾等水产动物的开口饵料，而且萼花臂尾轮虫这一活饵料的培养好坏常常是导致水产苗种生产成败的关键因素；另外，由于萼花臂尾轮虫在水体中分布广泛、体型微小、对环境污染物的敏感性较高，因而也可较好地将其作为水域生态和环境检测的重要指示生物。饵料的投食在萼花臂尾轮虫的培养过程中是最不可缺少的，好坏直接影响到萼花臂尾轮虫的生长。

通常，富营养化水体的氨氮含量较高，尤其在水产养殖池塘和萼花臂尾轮虫专门培育池中，由于生产上常采用施肥培养单胞藻或直接泼洒豆浆等方法培养萼花臂尾轮虫以及水生动物的排泄物、粪便及残饵等有机物的不断分解，导致水体的氨氮大量积累，这可能是影响其生长、繁殖等种群增长的重要制约因素之一。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明的目的在于提供一种氨氮对萼花臂尾轮虫的毒性检测方法，以解决现有技术不足导致的诸多问题。

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种氨氮对萼花臂尾轮虫的毒性检测方法，包括一种萼花臂尾轮虫的培养方法，所述萼花臂尾轮虫培养方法采用单胞藻和酵母混合饵料投食并添加微量元素；所述投食的频率为1次/天，投食密度为2×106个/ml；所述微量元素添加量为：FeC6H5O75×10-7mol/L、CuSO43×10-8mol/L、CuSO48×10-8mol/L、MnSO43×10-8mol/L、CoCl24×10-8mol/L、NiSO45×10-8mol/L、NaMoO71×10-9mol/L；

所述氨氮对萼花臂尾轮虫毒性的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

1)分别设定7个不同质量浓度梯度的氨氮微孔培养板，且浓度梯度分别为1.5mg/L、2.5mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、20.0mg/L、25.0mg/L、30.0mg/L，用分析纯级NH4Cl配制，另设1个未添加氨氮的对照微孔培养板；

2)用吸管随机吸取预培养的不带卵、个体较大、游动活跃的萼花臂尾轮虫，置于含不同氨氮浓度梯度的微孔培养板中，每孔含10个萼花臂尾轮虫个体和10mL试验溶液，盖上盖子以防水分蒸发；

3)将微孔培养板在恒温培养箱中培养，pH为7.5±0.2，投食密度为4×106cell/mL；

4)在实验开始后的第6h、24h、48h、96h用解剖镜观察萼花臂尾轮虫的存活情况，及时挑出并记录个体死亡数；在萼花臂尾轮虫培养24h后分别取样，萼花臂尾轮虫样品用生理盐水润洗、过滤，滤纸吸干水分，准确称量后，在冰冷的研钵中用质量体积1：9的匀浆介质制成组织匀浆，4℃下离心10min，离心条件为5000r/min，取上清液待用，采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒，按说明书测定萼花臂尾轮虫H2O2和MDA含量以及SOD、CAT酶活性。

本发明的优点在于，本方案采用单胞藻和酵母混合饵料投食并添加微量元素，相比其它的投食方式，具有萼花臂尾轮虫的增长速度快，生长状态好，出现死亡萼花臂尾轮虫数量少的优点，且通过所述测定氨氮浓度对萼花臂尾轮虫毒性的检测方法，能较好的控制水体环境，保证投食效果。

附图说明

如图1为本发明实施例中氨氮胁迫浓度(A)和氨氮胁迫时间(B)分别对萼花臂尾轮虫体内H2O2含量影响的对比图；

如图2为本发明实施例中氨氮胁迫浓度(A)和氨氮胁迫时间(B)分别对萼花臂尾轮虫体内SOD含量影响的对比图；

如图3为本发明实施例中氨氮胁迫浓度(A)和氨氮胁迫时间(B)分别对萼花臂尾轮虫体内CAT含量影响的对比图；

如图4为本发明实施例中氨氮胁迫浓度(A)和氨氮胁迫时间(B)分别对萼花臂尾轮虫体内MDA含量影响的对比图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述，以下实施例可以使本专业技术人员更全面的理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

一种氨氮对萼花臂尾轮虫的毒性检测方法，所述培养方法采用单胞藻和酵母混合饵料投食并添加微量元素。

在本实例中，所述投食的频率为1次/天，投食密度为2×106个/ml。

在本实例中，所述微量元素添加量为：FeC6H5O75×10-7mol/L、CuSO43×10-8mol/L、CuSO48×10-8mol/L、MnSO43×10-8mol/L、CoCl24×10-8mol/L、NiSO45×10-8mol/L、NaMoO71×10-9mol/L。

所述氨氮对萼花臂尾轮虫毒性的检测方法，所述检测方法包括如下步骤：

1)分别设定质量浓度梯度为1.5mg/L、2.5mg/L、10.0mg/L、15.0mg/L、20.0mg/L、25.0mg/L、30.0mg/L的氨氮微孔培养板，用分析纯级NH4Cl配制，另设1个未添加氨氮的对照微孔培养板；

2)用吸管随机吸取预培养的不带卵、个体较大、游动活跃的萼花臂尾轮虫，置于含不同氨氮浓度梯度的微孔培养板中，每孔含10个萼花臂尾轮虫个体和10mL试验溶液，盖上盖子以防水分蒸发；

3)将微孔培养板在恒温培养箱中培养，pH为7.5±0.2，投食密度为4×106cell/mL；

4)在实验开始后的第6h、24h、48h、96h用解剖镜观察萼花臂尾轮虫的存活情况，及时挑出并记录个体死亡数，在萼花臂尾轮虫培养24h后分别取样，萼花臂尾轮虫样品用生理盐水润洗、过滤，滤纸吸干水分，准确称量后，在冰冷的研钵中用质量体积1：9的匀浆介质制成组织匀浆，4℃下离心10min，离心条件为5000r/min，取上清液待用，采用苏州科铭生物技术有限公司的试剂盒，按说明书测定萼花臂尾轮虫H2O2和MDA含量以及SOD、CAT酶活性。

如图1及图4所示，当氨氮浓度达到2.5mg/L时，萼花臂尾轮虫体内24h内H2O2、MDA含量均显著上升(P<0.5)；如图2及图3所示，当氨氮浓度达到1.5mg/L时，萼花臂尾轮虫体内24h内SOD活性显著下降(P<0.5)，而CAT的活性在氨氮浓度达到10mg/L时才出现显著下降(P<0.5)；如图1至图4中B组实验所示，其中氨氮胁迫浓度均为12.3mg/L，其SOD活性、CAT活性分别在12h和24h出现显著下降(P<0.5)，H2O2、MDA含量均在12h出现显著升高(P<0.5)。因此，测定萼花臂尾轮虫体内的H2O2、MDA含量和SOD活性变化能准确灵敏地检测氨氮对萼花臂尾轮虫急性毒性。

表1

注：实验期间水温为24.0～25.0℃，溶解氧6.5～6.8mg/L，pH值为7.2～7.6。

基于上述，本方案采用单胞藻和酵母混合饵料投食，混合投喂相比其它的投食饵料，萼花臂尾轮虫的增长速度快，生长状态好，出现死亡萼花臂尾轮虫数量少，且如表1所示，随着氨氮浓度从0mg/L逐渐增加到30mg/L，萼花臂尾轮虫的死亡率总体呈增加趋势，在胁迫6h、12h、24h、48h和96h各时间段的萼花臂尾轮虫死亡率随环境氨氮浓度增加而升高的相关系数分别为：0.9592、0.9235、0.9653、0.9564、0.9585，均具有很好的线性关系；对表1的数据作直线回归处理，得出24h萼花臂尾轮虫死亡率随不同氨氮浓度变化的回归方程：Y＝50.915x-5.535(R2＝0.9653)，从而计算出萼花臂尾轮虫的24h半致死氨氮浓度(24h LC50)值为12.3mg/L，95％置信区间为9.8～15.5mg/L；同理得出48h的回归方程为：Y＝65.008x-3.7087(R2＝0.9031)和48h LC50为6.7mg/L，95％置信区间为5.6～8.0mg/L；96h回归方程为Y＝69.694x+18.891(R2＝0.9911)和96h LC50为2.8mg/L，95％置信区间为2.3～3.3mg/L。按常规方法，通过24h LC50×0.1计算得到萼花臂尾轮虫对氨氮的安全浓度(SC)为1.23mg/L。

由技术常识可知，本发明可以通过其他的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现。因此，上述公开的实施方案，就各方面而言，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明所包含。

本文标签： 毒性检测方法轮虫萼花臂尾