一种微生物食品抗氧化剂的生产方法

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本发明提供了一种微生物食品抗氧化剂的生产方法，其特征在于，包括：将沼泽红假单胞菌、葡萄酒饱汉逊酵母和保加利亚乳杆菌分别在各自的培养基上培养；将所得的培养物分别接种到溶菌肉汤培养基中，在摇瓶内培养；将灭菌后的发酵基料加入发酵罐中，将沼泽红假单胞菌培养物、葡萄酒饱汉逊酵母培养物和保加利亚乳杆菌培养物皆接种到所述发酵基料中；将所得液体灭菌；曝气，即得到微生物食品抗氧化剂。本发明进入人体后，其所含的抗自由基物质能抵抗体内过量的自由基，避免组织的氧化损伤，有效清除体内产生的活性氧自由基，保护细胞膜的正常机构，保证体内活性分子的正常功能。

1.一种微生物食品抗氧化剂的生产方法，其特征在于，包括：第一步：将沼泽红假单胞菌、葡萄酒饱汉逊酵母和保加利亚乳杆菌分别在各自的培养基上在25～35℃培养30～50小时，在2～6℃保存备用；第二步：将第一步所得的沼泽红假单胞菌培养物、葡萄酒饱汉逊酵母培养物和保加利亚乳杆菌培养物分别接种到溶菌肉汤培养基中，在摇瓶内30～40℃培养8-12小时；第三步：将灭菌后的发酵基料加入发酵罐中，将第二步所得的沼泽红假单胞菌培养物、葡萄酒饱汉逊酵母培养物和保加利亚乳杆菌培养物皆按0.1～1:100的重量比接种到所述发酵基料中，密闭发酵7-14天；第四步：将第三步所得的发酵液离心，将所得液体灭菌；第五步：将第四步所得的灭菌后的液体通入无菌空气进行曝气，即得到微生物食品抗氧化剂。 2.如权利要求1所述的微生物食品抗氧化剂的生产方法，其特征在于，所述第二步中，沼泽红假单胞菌培养物、葡萄酒饱汉逊酵母培养物和保加利亚乳杆菌培养物和溶菌肉汤培养基的重量比分别为0.5～2:100、1.0～5:100和0.5～4:100。 3.如权利要求1所述的微生物食品抗氧化剂的生产方法，其特征在于，所述第三步中，发酵罐用温度为120-125℃、压力为0.142-0.152Mpa的蒸汽灭菌20-35min。 4.如权利要求1所述的微生物食品抗氧化剂的生产方法，其特征在于，所述第三步中，发酵基料用巴氏消毒方法在70-80℃灭菌10-20min。 5.如权利要求1所述的微生物食品抗氧化剂的生产方法，其特征在于，所述第三步中，发酵基料由下述以重量百分比计的原料组成：苦荞麦壳粉0.01-1%、土豆0.1-2%、沙棘0.1-2%、蜂蜜1-4%、豆粕0.5-3%、麸皮2-5%和无菌水83-96.2%。 6.如权利要求1所述的微生物食品抗氧化剂的生产方法，其特征在于，所述第四步中，所得液体在85-95℃温度下灭菌30-60min。 7.如权利要求1所述的微生物食品抗氧化剂的生产方法，其特征在于，所述第五步中，所述曝气的通气量为1：0.2，曝气时间为8-12天。

技术领域

本发明涉及一种微生物食品抗氧化剂的生产方法，该微生物抗氧化剂可延长食品保质期及货架期，同时可促使营养物质的转化吸收、提高机体免疫力和抵抗力，有利于对各种疾病的预防和康复，属于食品添加剂及保健食品技术领域。

背景技术

受益于食品工业的稳定持续发展，食品添加剂工业也处于稳定快速发展之中。目前，全世界实际使用的食品添加剂已超过了5000种，年贸易额超过200亿美元，并且以较快速度递增，已成为食品工业中颇具生机和活力的领域之一。在目前使用的数千种食品添加剂中，80%以上是化学合成的，随着食品安全问题日益成为全球性关注的焦点，化学合成的食品添加剂因存在种种安全性问题，正面临着十分严峻的困境。如何走出困境，已成为所有从事与食品添加剂有关的教学、研发、管理、生产及流通等工作的人们有待解决的难题。实践证明，大力开展天然食品添加剂的研发是食品添加剂行业走出安全性困境的有效途径之一。事实上，从20世纪八九十年代开始，天然食品添加剂的研发工作就受到前所未有的重视，各种来源的天然食品添加剂也不断问世，形成了一种快速发展的良好态势。

现代医学证明，生物体许多疾病的发生大多是机体内不饱和脂肪酸共价键上一系列自由基的反应诱导所致。最新研究证明，氧自由基可使生物蛋白聚合，核酸主键断裂、碱基修饰和氢键破坏，从而使机体内大分子物质产生过氧化变性、交联或断裂，引起细胞机构和功能的破坏，导致机体组织损伤和器官的退行性变化。

在机体内的超量自由基攻击机体细胞膜富含的脂质和蛋白质，产生脂质过氧化反应，导致脂质过氧化物的积累；超量自由基还攻击生物膜及DNA键，破坏其结构，使其功能丧失；超量自由基又攻击酶邻近特定氨基酸残基，使酶失活，并使机体抗氧化功能减弱，最终引起机体免疫力下降。

根据检索的结果，目前涉及微生物食品抗氧化剂的专利很少，且提供方法工艺繁琐和成本高等特点。

发明内容

 本发明的目的是提供一种步骤简单且成本低的微生物食品抗氧化剂的生产方法，所制得的微生物食品抗氧化剂具有较好的抗氧化功能。

    为了达到上述目的，本发明提供了一种微生物食品抗氧化剂的生产方法，其特征在于，包括：

第一步：将沼泽红假单胞菌、葡萄酒饱汉逊酵母和保加利亚乳杆菌分别在各自的培养基上在25～35℃培养30～50小时，在2～6℃保存备用；

第二步：将第一步所得的沼泽红假单胞菌培养物、葡萄酒饱汉逊酵母培养物和保加利亚乳杆菌培养物分别接种到溶菌肉汤培养基中，在摇瓶内30～40℃培养8-12小时；

第三步：将灭菌后的发酵基料加入发酵罐中，将第二步所得的沼泽红假单胞菌培养物、葡萄酒饱汉逊酵母培养物和保加利亚乳杆菌培养物皆按0.1～1:100的重量比接种到所述发酵基料中，密闭发酵7-14天；

第四步：将第三步所得的发酵液离心，将所得液体灭菌；

第五步：将第四步所得的灭菌后的液体通入无菌空气进行曝气，即得到微生物食品抗氧化剂。

优选地，所述第二步中，沼泽红假单胞菌培养物、葡萄酒饱汉逊酵母培养物和保加利亚乳杆菌培养物和溶菌肉汤培养基的重量比分别为0.5～2:100、1.0～5:100和0.5～4:100。

优选地，所述第三步中，发酵罐用温度为120-125℃、压力为0.142-0.152Mpa的蒸汽灭菌20-35min。

优选地，所述第三步中，发酵基料用巴氏消毒方法在70-80℃灭菌10-20min。

优选地，所述第三步中，发酵基料由下述以重量百分比计的原料组成：苦荞麦壳粉0.01-1%、土豆0.1-2%、沙棘0.1-2%、蜂蜜1-4%、豆粕0.5-3%、麸皮2-5%和无菌水83-96.2%。

优选地，所述第四步中，所得液体在85-95℃温度下灭菌30-60min。

优选地，所述第五步中，所述曝气的通气量为1：0.2，曝气时间为8-12天。

本发明的有益效果如下：

1、本发明选用了沼泽红假单胞，葡萄酒饱汉逊酵母，保加利亚乳杆菌，进行优化培养后，加以协同复合发酵工艺的利用，多级厌氧发酵，得到了多样的生物代谢活性产物，所得到的微生物抗氧剂是一种褐色的液体制剂，内含有丰富的胡萝卜素、维生素B1、B2、及B12、栎素、类黄酮类物质、肌醇、L-天门冬氨基酸及多种微量元素的金属衍生物。进入人体后，其所含的抗自由基物质能抵抗体内过量的自由基，避免组织的氧化损伤，有效清除体内产生的活性氧自由基，保护细胞膜的正常机构，保证体内活性分子的正常功能。

2、本发明所得的微生物食品抗氧化剂安全性高、抗氧化能力强、无副作用、对食品有较强的防腐保鲜功能。

3、本发明所得的微生物食品抗氧化剂还可起到营养和修复细胞、促进细胞代谢的作用，形成人机体内良好的生态环境，促进营养物质的转化吸收、提高机体免疫力，有利于对各种疾病的预防和康复。

附图说明

图1为抗脂质过氧化测试图。

具体实施方式

 下面结合实施例来具体说明本发明。实施例1～3中的沼泽红假单胞菌、葡萄酒饱汉逊酵母和保加利亚乳杆菌从中国农业微生物菌种保藏管理中心购买，沼泽红假单胞菌（Rhodopseudomonas palustris，ACCC10649）,葡萄酒饱汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum,ACCC20310），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus,ACCC10638）。实施例中的溶菌肉汤培养基购自上海西域机电系统有限公司购买，型号：HB0147。

实施例1

（1）、将沼泽红假单胞菌以重量比2：100接种到溶菌肉汤培养基中，在25℃厌氧培养50小时，在2℃保存备用；将葡萄酒饱汉逊酵母以重量比2：100接种到溶菌肉汤培养基中，在25℃厌氧培养50小时，在2℃保存备用；将保加利亚乳杆菌以重量比2：100：接种到溶菌肉汤培养基中， 在25℃厌氧培养50小时，在2℃保存备用；

（2）、将步骤（1）所得到沼泽红假单胞菌、葡萄酒饱汉逊酵母、保加利亚乳杆菌分别以重量比0.5:100、1.5:100、1.0:100接种到溶菌肉汤培养基中，分别在摇瓶内30℃厌氧培养12小时；

（3）、将发酵罐用温度120℃压力为0.152Mpa的蒸汽灭菌35min，加入发酵基料，用巴氏消毒70℃灭菌20min，所述发酵基料由下述重量百分比的原料组成：苦荞麦壳粉0.04%、土豆0.1%、沙棘0.3%、蜂蜜1%、豆粕2.5%、麸皮4%和无菌水92.06%；灭菌后冷却至25℃，将步骤（2）所得的三种培养物皆按0.1:100的重量比接种到所述发酵基料中，密闭发酵14天。

（4）发酵结束后，将发酵液通过螺旋沉降离心机后再进入碟式离心机，将离心后得到的液体在85℃温度下灭菌消毒60min；

（5）在灭菌后的液体中通入无菌空气进行曝气，通气量1:0.2,曝气8天；将曝气后的液体灌装到消毒好的瓶子中，即得到水溶性微生物食品抗氧化剂。

实施例2

（1）、将沼泽红假单胞菌以重量比4：100接种到溶菌肉汤培养基中，在30℃厌氧培养40小时，在2℃保存备用；将葡萄酒饱汉逊酵母以重量比4：100接种到溶菌肉汤培养基中，在30℃厌氧培养40小时，在2℃保存备用；将保加利亚乳杆菌以重量比4：100接种到溶菌肉汤培养基中，在30℃厌氧培养40小时，在4℃保存备用；

（2）、将步骤（1）所得到沼泽红假单胞菌、葡萄酒饱汉逊酵母、保加利亚乳杆菌分别以重量比1:100、2.0:100和1.5:100接种到溶菌肉汤培养基中，分别在摇瓶内35℃厌氧培养10小时；

（3）、将发酵罐用温度121℃压力为0.148Mpa的蒸汽灭菌30min，加入发酵基料，用巴氏消毒75℃灭菌15min，所述发酵基料由下述重量百分比的原料组成：苦荞麦壳粉0.06%、土豆0.12%、沙棘0.4%、蜂蜜1.3%、豆粕3.5%、麸皮3%和无菌水91.62%；灭菌后冷却至30℃，将步骤（2）所得的三种培养物皆按0.5:100的重量比接种到所述发酵基料中，密闭发酵10天。

（4）、发酵结束后，将发酵液通过螺旋沉降离心机后再进入碟式离心机，将离心后得到的液体在90℃温度下灭菌消毒45min；

（5）、在灭菌后的液体中通入无菌空气进行曝气，通气量1:0.2,曝气10天；将曝气后的液体灌装到消毒好的瓶子中，即得到水溶性微生物食品抗氧化剂。

实施例3

（1）、将沼泽红假单胞菌以重量比3：100接种到溶菌肉汤培养基中，在35℃厌氧培养30小时，在6℃保存备用；将葡萄酒饱汉逊酵母以重量比3：100接种到溶菌肉汤培养基中，在35℃厌氧培养30小时，在6℃保存备用；将保加利亚乳杆菌以重量比3：100接种到溶菌肉汤培养基中，在35℃厌氧培养30小时，在6℃保存备用；

（2）、将步骤（1）所得到沼泽红假单胞菌、葡萄酒饱汉逊酵母、保加利亚乳杆菌分别以重量比1.5:100、2.5:100和2.0:100接种到溶菌肉汤培养基中，分别在摇瓶内40℃厌氧培养8小时； 

（3）、将发酵罐用温度125℃压力为0.142Mpa的蒸汽灭菌20min，加入发酵基料，用巴氏消毒80℃灭菌10min，所述发酵基料由下述重量百分比的原料组成：苦荞麦壳粉0.08%、土豆0.4%、沙棘0.6%、蜂蜜1.5%、豆粕3.8%、麸皮3.2%和无菌水90.42%；灭菌后冷却至40℃，将步骤（2）所得的三种培养物皆按1:100的重量比接种到所述发酵基料中，密闭发酵14天。

（4）、发酵结束后，将发酵液通过螺旋沉降离心机后再进入碟式离心机，将离心后得到的液体在95℃温度下灭菌消毒30min；

（5）在灭菌后的液体中通入无菌空气进行曝气，通气量1:0.2,曝气12天；将曝气后的液体灌装到消毒好的瓶子中，即得到水溶性微生物食品抗氧化剂。

本发明所得微生物食品抗氧化剂的使用方法如下：直接按照生产需要适量使用添加到食品中，也可作为保健食品原料使用，本发明不可与降酸性物质同时使用；产品常温避光存放，保质期18个月。

通过以下实验观察本发明产品对食品安全性和抗氧化功能的效果：

1.本发明产品急性毒性试验：

样品：本发明的微生物食品抗氧化剂，为褐色液体；

试验动物：健康清洁级昆明种小鼠40只，体重为18-22g，雌雄各半，动物来源于复旦大学实验动物部，合格证号为SCXK 沪2002-0002，分成四组。

剂量与试验方法：将本发明的微生物食品抗氧化剂用蒸馏水稀释10倍后，灌胃给予动物，灌胃前禁食12小时，各组的微生物食品抗氧化剂灌胃量分别为4.64ml/kgbw、10.0ml/kgbw、21.5ml/kgbw和46.4ml/kgbw，分次灌胃，每次间隔4小时，共灌胃5次，灌胃后连续观察二周。

    结果：动物未见急性中毒症状及死亡现象，结果见表1

表1   样品对小鼠的急性毒性试验结果

由上述结果可见，样品对雌雄小鼠的经口LD50大于46.4g/kgbw，说明本发明微生物食品抗氧化剂产品是安全无毒的。

2.本发明产品功能性试验：

2.1原理：脂质过氧化产物丙二醛(MDA) + 硫代巴比妥酸(TBA) → 三甲川棕色 530nm (532nm)最大吸收

     计算公式：抑制率(%) = [( A0 –Ax) / A0) ] * 100%  

A0：对照溶液的吸光度

      Ax：试样溶液的吸光度

2.2仪器：722型分光光度计；具塞试管；

2.3试剂：

1.0% TBA溶液（TBA 1.0g + 蒸馏水100ml 加热溶解，棕色瓶保存）,

三氯甲烷 

3% 过氧化氢(新鲜配制)

2.4操作步骤：

(1) 市售的植物油0.2ml、3% 过氧化氢(新鲜配制) 1.0ml、1.0% TBA溶液5ml、试样液 0.4ml混匀 ，37℃水浴30min，自来水冷却；

(2) 步骤(1)中混合液 + 蒸馏水定容到10ml + 三氯甲烷 1ml 盖塞上下倒置10次，10min静置到澄清（如混浊可离心5min）；

(3) 将(2)倒入比色杯，530nm(532nm) 测定吸光度。

2.5结果：

试样液 抗脂质过氧化率（%） 50%本发明所得微生物食品抗氧化剂抗氧化剂（Ky） 75.49 本发明所得微生物食品抗氧化剂（Ky） 90.20 50%恒顺香醋（Xc） 65.69 恒顺香醋（Xc） 67.32 5mg/ml 维生素C（Vc） 82.03 5mg/ml维生素E（Ve） 12.25

3.对微生物食品抗氧化剂中各个成分检测数据如下：

检测编号 检测项目 检测结果 1 总黄酮，mg/100g 610 2 铁（以Fe计），mg/kg 503 3 锰（以Mn计），mg/kg 367 4 硒（以Se计），mg/kg 0.18 5 总氨基酸，% 4.21 6 人参总皂甙，mg/100g 24 7 SOD，U/ml 1940

本文标签： 抗氧化剂微生物方法食品