一种黑果枸杞的快速组培方法

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本发明公开了一种黑果枸杞的快速组培方法，属于植物组织培养技术领域，它包括外植体灭菌，诱导培养，生根培养，继代培养和炼苗移栽的步骤。本发明中继代培养过程中可同时进行生根培养，组培效率高，操作简便，周期短，能快速获得完整植株；组培过程不受环境因素的影响。

1.一种黑果枸杞的快速组培方法，其特征在于，它包括以下步骤：（1）外植体灭菌：取成年黑果枸杞枝条上的当年生幼嫩茎段和茎尖用流水冲洗3～5min，75%酒精灭菌4～7s，无菌水清洗2～3遍，0.1%氯化汞溶液灭菌13～17min，无菌水清洗4～6遍；（2）诱导培养：将灭菌后的嫩茎段和茎尖接种到诱导培养基中，在培养室中培养25～45天腋芽伸长至3～5cm；（3）生根培养：将腋芽剪下，接种到生根培养基中，25～40天得到长为6～10cm的黑果枸杞组培苗，根长为5～10cm；（4）继代培养：以黑果枸杞组培苗为母体，将其切割成带2～3个芽点的茎段或茎尖，接种到继代培养基中进行继代，同时进行生根培养，在培养室中培养29～32天得到高度为6.8～8.0cm的黑果枸杞完整植株；（5）炼苗移栽：将得到的黑果枸杞完整植株在自然光下闭瓶锻炼5～8天，在室温下开盖炼苗3～5天，取出单苗洗净根部的培养基，用1000倍多菌灵溶液对根消毒3～5min，晾干栽入基质中，当小苗长出的新根系长达3～5cm且长出侧根时移栽到土壤中；其中，步骤（2）中所述的培养基为MS+0.5mg/L6-BA+0.1mg/LNAA；步骤（2）中所述的培养室内条件为：光照强度1500LX，光照时间12～16h/天，温度24～26℃；步骤（3）和步骤（4）中所述的培养基为1/2MS+0.1mg/LNAA。 2.根据权利要求1所述的一种黑果枸杞的快速组培方法，其特征在于，步骤（3）和步骤（4）中所述的培养室内条件：光照强度3000LX，光照时间12～16h/天，温度24～26℃。 3.根据权利要求1所述的一种黑果枸杞的快速组培方法，其特征在于，步骤（5）中所述的基质为珍珠岩和泥炭混合，两者重量比为1:1.5～2.5。 4.根据权利要求1所述的一种黑果枸杞的快速组培方法，其特征在于，步骤（5）中所述的基质用0.1%高锰酸钾溶液消毒。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种组培方法，具体涉及一种黑果枸杞的快速组培方法。

背景技术

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）为茄科枸杞属植物，是一种盐生药用植物，为多棘刺灌木。黑果枸杞味甘、性平，不仅富含蛋白质、枸杞多糖、氨基酸、维生素、矿物质、微量元素等多种营养成分，还含有丰富的黑果色素-天然原花青素，其中红果枸杞不含有原花青素，黑果枸杞的原花青素含量超过蓝莓，是迄今发现的原花青素含量最高的天然野生植物。同时，黑果枸杞具有抗旱、抗寒、耐盐碱、根蘖性强和耐土壤贫瘠等诸多优点，是盐碱地治理、护坡、防止水土流失的良好树种。因此，黑果枸杞无论在经济产品开发，还是在生态环境治理方面都具有广泛的市场前景和开发潜力，可以成为医药保健、经济林建设和盐碱地生物防治的重要经济树种。

目前，黑果枸杞主要是野生为主，但野生资源主要分布区自然条件恶劣，植被退化严重，甚至成片死亡，已对黑果枸杞的正常生存造成了严重威胁，基本处于濒危状态。现在，关于黑果枸杞的研究绝大多数集中在对其生理生态、有效成分分析、开发利用以及治理荒漠化和野生种源驯化方面，而关于黑果枸杞的组培技术的研究报道很少。浩仁塔本等（2005）利用带腋芽的茎段对黑果枸杞进行了分化生根及愈伤组织诱导不定芽增殖进行了研究，仅仅只涉及组织培养，未对其快速培养进行研究；专利申请号201310094393.2涉及黑果枸杞优质种苗快速繁殖的方法，需要选择黑果枸杞优质种子，用75%酒精消毒，无菌水冲洗3～4次；再用0.1%的升汞消毒，无菌水冲洗3～4次后将种子接种于MS培养基中培养无菌苗，培养1个月后，将无菌苗的茎杆剪下，切成0.5cm长短的茎段，接入MS+KH2PO413.5mg/L+NAA0.1mg/L 培养基中继续进行培养，并未对其外植体的组织培养作详细的说明。

发明内容

本发明利用组织培养技术，进行外植体培养获得了黑果枸杞完整植株，提供了一种黑果枸杞的快速组培方法，组培流程简便，不受季节气候变化影响，为黑果枸杞工业化育苗提供了技术支持。

本发明首先利用植物组织培养技术获得黑果枸杞组培苗，再通过直接诱导幼嫩茎段和茎尖腋芽生长，腋芽生根培养，切割茎段或茎尖培养繁殖。

本发明的目的通过以下技术方案实现：一种黑果枸杞的快速组培方法，它包括以下步骤：

（1）外植体灭菌：取成年黑果枸杞枝条上的当年生幼嫩茎段和茎尖用流水冲洗3～5min，75%酒精灭菌4～7s，无菌水清洗2～3遍，0.1%氯化汞溶液灭菌13～17min，无菌水清洗4～6遍；

（2）诱导培养：将灭菌后的嫩茎段和茎尖接种到诱导培养基中，在培养室中培养25～45天腋芽伸长至3～5cm；

（3）生根培养：将腋芽剪下，接种到生根培养基中，25～40天得到长为6～10cm的黑果枸杞组培苗，根长为5～10cm；

（4）继代培养：以黑果枸杞组培苗为母体，将其切割成带2～3个芽点的茎段或茎尖，接种到继代培养基中进行继代，同时进行生根培养，在培养室中培养29～32天得到高度为6.8～8.0cm的黑果枸杞完整植株；

（5）炼苗移栽：将得到的黑果枸杞完整植株在自然光下闭瓶锻炼5～8天，在室温下开盖炼苗3～5天，取出单苗洗净根部的培养基，用1000倍多菌灵溶液对根消毒3～5min，晾干栽入基质中，当小苗长出的新根系长达3～5cm且长出侧根时移栽到土壤中。

步骤（2）中所述的培养基为MS + 0.5mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA。

步骤（2）中所述的培养室内条件为：光照强度1500LX，光照时间12～16h/天，温度24～26℃。

步骤（3）和步骤（4）中所述的培养基为1/2MS + 0.1mg/L NAA。

步骤（3）和步骤（4）中所述的培养室内条件：光照强度3000LX，光照时间12-16h/天，温度24～26℃。

步骤（5）中所述的基质为珍珠岩和泥炭混合，两者重量比为1:1.5～2.5。

步骤（5）中所述的基质用0.1%高锰酸钾溶液消毒。

所述移栽到土壤中后培养3～5周后见到新叶开始生长，表明移栽的黑果枸杞成活。

本发明具有以下有益效果：

（1）本发明中黑果枸杞组培苗继代培养的同时，可进行生根培养，减少了操作步骤，提高了组培的效率，能快速获得生长健壮、遗传性状一致的完整组培苗，是黑果枸快速杞组培的一种有效途径；

（2）本发明中步骤（3）和步骤（4）接种的培养基相同，减少了培养基更换的过程，简化了组培流程，操作简便，周期短，能够快速的获得黑果枸杞完整植株；

（3）本发明利用组织培养技术，进行外植体培养获得了黑果枸杞完整植株，不受季节气候变化、自然灾害的影响，为黑果枸杞工业化育苗提供了技术支持；

（4）本发明解决了黑果枸杞繁殖能力低、资源匮乏及农药残留的问题，缓解野生黑果枸杞资源紧张，保护野生黑果枸杞资源，可在保护基础上充分合理开发利用，发挥黑果枸杞的经济价值。

附图说明

图1是本发明所述的黑果枸杞诱导培养中腋芽；

图2是本发明所述的黑果枸杞生根培养10天时腋芽生根情况；

图3是本发明所述的黑果枸杞生根培养30天时腋芽生根情况；

图4是本发明所述的黑果枸杞生根培养中得到的黑果枸杞组培苗；

图5是本发明所述的黑果枸杞继代培养中生根培养情况。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。

实施例1：一种黑果枸杞的快速组培方法，它包括以下步骤：

（1）外植体灭菌：取成年黑果枸杞枝条上的当年生幼嫩茎段和茎尖用流水冲洗3min，75%酒精灭菌7s，无菌水清洗3遍，0.1%氯化汞溶液灭菌13min，无菌水清洗4遍；

（2）诱导培养：将灭菌后的嫩茎段和茎尖接种到MS + 0.5mg/L 6-BA + 0.1mg/LNAA培养基中，在光照强度为1500LX，光照时间为16h/天，温度为24℃的培养室中培养25天，腋芽平均伸长至3cm；

（3）生根培养：将腋芽剪下，接种到1/2MS + 0.1mg/L NAA培养基中，在光照强度为3000LX，光照时间为16h/天，温度为24℃的培养室中培养25天，得到高度平均为6cm的黑果枸杞组培苗，根长平均为5cm；

（4）继代培养：以黑果枸杞组培苗为母体，将其切割成带2个芽点的茎段或茎尖，接种到1/2MS + 0.1mg/L NAA培养基中，进行继代，同时进行生根培养，在光照强度为3000LX，光照时间为16h/天，温度为24℃的培养室中培养29天，得到高度平均为6.8cm的黑果枸杞完整植株；

（5）炼苗移栽：将得到的黑果枸杞完整植株在自然光下闭瓶锻炼5天，在室温下开盖炼苗3天，取出单苗洗净根部的培养基，用1000倍多菌灵溶液对根消毒3min，晾干栽入用0.1%高锰酸钾溶液消毒后的基质中，当小苗长出的新根系平均长达3cm且长出侧根时移栽到土壤中，其中基质为珍珠岩和泥炭混合，两者重量比为1:1.5。

移栽到土壤中后培养3周后见到新叶开始生长，表明移栽的黑果枸杞成活，再过2周调查黑果枸杞的成活率，成活率平均为75%。

实施例2：一种黑果枸杞的快速组培方法，它包括以下步骤：

（1）外植体灭菌：取成年黑果枸杞枝条上的当年生幼嫩茎段和茎尖用流水冲洗5min，75%酒精灭菌4s，无菌水清洗2遍，0.1%氯化汞溶液灭菌17min，无菌水清洗6遍；

（2）诱导培养：将灭菌后的嫩茎段和茎尖接种到MS + 0.5mg/L 6-BA + 0.1mg/LNAA培养基中，在光照强度为1500LX，光照时间为12h/天，温度为26℃的培养室中培养45天，腋芽平均伸长至5cm；

（3）生根培养：将腋芽剪下，接种到1/2MS + 0.1mg/L NAA培养基中，在光照强度为3000LX，光照时间为12h/天，温度为26℃的培养室中培养40天，得到高度平均为10cm的黑果枸杞组培苗，根长平均为10cm；

（4）继代培养：以黑果枸杞组培苗为母体，将其切割成带3个芽点的茎段或茎尖，接种到1/2MS + 0.1mg/L NAA培养基中，进行继代，同时进行生根培养，在光照强度为3000LX，光照时间为12h/天，温度为26℃的培养室中培养32天，得到高度平均为8cm的黑果枸杞完整植株；

（5）炼苗移栽：将得到的黑果枸杞完整植株在自然光下闭瓶锻炼8天，在室温下开盖炼苗5天，取出单苗洗净根部的培养基，用1000倍多菌灵溶液对根消毒5min，晾干栽入用0.1%高锰酸钾溶液消毒后的基质中，当小苗长出的新根系平均长达5cm且长出侧根时移栽到土壤中，其中基质为珍珠岩和泥炭混合，两者重量比为1:2.5。

移栽到土壤中后培养5周后见到新叶开始生长，表明移栽的黑果枸杞成活，再过2周调查黑果枸杞的成活率，成活率平均为75%。

实施例3：一种黑果枸杞的快速组培方法，它包括以下步骤：

（1）外植体灭菌：取成年黑果枸杞枝条上的当年生幼嫩茎段和茎尖用流水冲洗4min，75%酒精灭菌5s，无菌水清洗2遍，0.1%氯化汞溶液灭菌14min，无菌水清洗5遍；

（2）诱导培养：将灭菌后的嫩茎段和茎尖接种到MS + 0.5mg/L 6-BA + 0.1mg/LNAA培养基中，在光照强度为1500LX，光照时间为14h/天，温度为25℃的培养室中培养35天，腋芽平均伸长至4cm；

（3）生根培养：将腋芽剪下，接种到1/2MS + 0.1mg/L NAA培养基中，在光照强度为3000LX，光照时间为14h/天，温度为25℃的培养室中培养31天，得到高度平均为7cm的黑果枸杞组培苗，根长平均为7cm；

（4）继代培养：以黑果枸杞组培苗为母体，将其切割成带2个芽点的茎段或茎尖，接种到1/2MS + 0.1mg/L NAA培养基中，进行继代，同时进行生根培养，在光照强度为3000LX，光照时间为14h/天，温度为25℃的培养室中培养30天，得到平均高度为7.2cm的黑果枸杞完整植株；

（5）炼苗移栽：将得到的黑果枸杞完整植株在自然光下闭瓶锻炼6天，在室温下开盖炼苗4天，取出单苗洗净根部的培养基，用1000倍多菌灵溶液对根消毒4min，晾干栽入用0.1%高锰酸钾溶液消毒后的基质中，当小苗长出的新根系平均长达4cm且长出侧根时移栽到土壤中，其中基质为珍珠岩和泥炭混合，两者重量比为1:2.0。

移栽到土壤中后培养4周后见到新叶开始生长，表明移栽的黑果枸杞成活，再过2周调查黑果枸杞的成活率，成活率平均为75%。

实施例4：一种黑果枸杞的快速组培方法，它包括以下步骤：

（1）外植体灭菌：取成年黑果枸杞枝条上的当年生幼嫩茎段和茎尖用流水冲洗4min，75%酒精灭菌6s，无菌水清洗3遍，0.1%氯化汞溶液灭菌16min，无菌水清洗5遍；

（2）诱导培养：将灭菌后的嫩茎段和茎尖接种到MS + 0.5mg/L 6-BA + 0.1mg/LNAA培养基中，在光照强度为1500LX，光照时间为15h/天，温度为24℃的培养室中培养40天，腋芽平均伸长至4.5cm；

（3）生根培养：将腋芽剪下，接种到1/2MS + 0.1mg/L NAA培养基中，在光照强度为3000LX，光照时间为15h/天，温度为24℃的培养室中培养35天，得到高度平均为8cm的黑果枸杞组培苗，根长平均为8.5cm；

（4）继代培养：以黑果枸杞组培苗为母体，将其切割成带3个芽点的茎段或茎尖，接种到1/2MS + 0.1mg/L NAA培养基中，进行继代，同时进行生根培养，在光照强度为3000LX，光照时间为15h/天，温度为24℃的培养室中培养30天，得平均到高度为7.5cm的黑果枸杞完整植株；

（5）炼苗移栽：将得到的黑果枸杞完整植株在自然光下闭瓶锻炼8天，在室温下开盖炼苗5天，取出单苗洗净根部的培养基，用1000倍多菌灵溶液对根消毒5min，晾干栽入用0.1%高锰酸钾溶液消毒后的基质中，当小苗长出的新根系平均长达5cm且长出侧根时移栽到土壤中，其中基质为珍珠岩和泥炭混合，两者重量比为1:2.2。

移栽到土壤中后培养5周后见到新叶开始生长，表明移栽的黑果枸杞成活，再过2周调查黑果枸杞的成活率，成活率平均为75%。

从实施例1～4得出：本发明利用组织培养技术得到黑果枸杞组培苗，再通过直接诱导幼嫩茎段和茎尖腋芽生长，腋芽生根培养，切割成茎段或茎尖培养繁殖得到黑果枸杞的完整植株，炼苗移栽后的黑果枸杞成活率达到75%。

本文标签： 枸杞快速方法组培