一种大黄鱼植物乳杆菌饲料配方及其制备方法

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本发明公开了一种大黄鱼植物乳杆菌饲料配方及其制备方法，配方：植物乳杆菌1×106cfu/kg、菌体0.1g/kg、牛奶9.999g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg组成的喂养饲料和粗蛋白、粗脂、灰分和水分组成的基础饲料；按照质量百分比，喂养饲料为25.2％，粗蛋白47.3％、粗脂8.9％、灰分10.2％、水分8.4％。制备方法为：分离培养、收集植物乳杆菌、混合脱脂牛奶、添加基础饲料、混合配制。本发明促进了大黄鱼的体重增长率、摄食率、大黄鱼非特异性免疫性能的补体活性、溶菌酶活性、吞噬活性和头肾白细胞呼吸性，并增强对病菌抵抗力，有利于大黄鱼养殖业发展。

1.一种大黄鱼植物乳杆菌饲料配方，其特征在于，该大黄鱼植物乳杆菌饲料配方包括：植物乳杆菌1×10cfu/kg、菌体0.1g/kg、牛奶9.999g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg组成的喂养饲料和粗蛋白、粗脂、灰分和水分组成的基础饲料；按照质量百分比，喂养饲料为25.2％，粗蛋白47.3％、粗脂8.9％、灰分10.2％、水分8.4％。 2.如权利要求1所述的大黄鱼植物乳杆菌饲料配方，其特征在于，该大黄鱼植物乳杆菌饲料配方为：植物乳杆菌1×10cfu/kg、菌体0.1g/kg、牛奶9.99g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg、粗蛋白47.3％、粗脂8.9％、灰分10.2％、水分8.4％。 3.如权利要求1所述的大黄鱼植物乳杆菌饲料配方，其特征在于，该大黄鱼植物乳杆菌饲料配方为：植物乳杆菌1×10cfu/kg、菌体10g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg、粗蛋白47.3％、粗脂8.9％、灰分10.2％、水分8.4％。 4.一种大黄鱼植物乳杆菌饲料的制备方法，其特征在于，该大黄鱼植物乳杆菌饲料的制备方法包括以下步骤：从韩国腌白菜分离得到植物乳杆菌，37℃培养于含MRS肉汤的无菌烧瓶中，24小时后，15400×g离心5分钟，收集植物乳杆菌混合物；按1：4比例与脱脂牛奶混合，冷冻干燥，通过MRS琼脂平板记数测定植物乳杆菌混合物的生活力；按照植物乳杆菌1×10cfu/kg、菌体0.001g/kg、牛奶9.999g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg配置大黄鱼喂养饲料；加入成分为47.3％粗蛋白、8.9％粗脂、10.2％灰分和8.4％水分的基础饲料，混合制成大黄鱼植物乳杆菌饲料。 5.如权利要求4所述的大黄鱼植物乳杆菌饲料的制备方法，其特征在于，该大黄鱼植物乳杆菌饲料一天喂养大黄鱼两次。

技术领域

本发明属于大黄鱼养殖技术领域，尤其涉及一种大黄鱼植物乳杆菌饲料配 方及其制备方法。

背景技术

大黄鱼是我国独有的、经济价值很高的鱼类，是我国海水鱼类养殖中最为 名贵的品种之一。近年来，大黄鱼的养殖规模由于人工育苗的成功而迅速扩大， 由于过度捕捞，自然资源日益枯竭。人工育苗取得成功之后，大黄鱼的网箱规 模迅速扩大。网箱养殖的不合理规划导致养殖面积和放养密度急剧加大，使得 养殖水域的承载能力和水体交换自净能力遭到严重危害，鱼类病害的种类也随 之增多，极大地制约着大黄鱼养殖业的健康发展。随着养殖面积和放养密度急 剧加大，养殖环境遭到破坏，病害的种类也随之增多，发病次数日趋频繁，危 害性迅速增大，面临着许多与营养饲料有关的问题，极大制约着大黄鱼养殖业 的健康发展。例如，大黄鱼养殖常发生与病毒和细菌相关的疫情，造成严重的 经济损失。同时由于当前使用的饵料系数不达标，转化为鱼类蛋白的概率低， 导致饵料大量流失，对水质造成严重污染。尤其是部分养殖户违规使用禁用鱼 药和劣质饲料，造成药物残留和水质大面积恶化，导致大黄鱼生长速度减缓、 疾病频发，成活率下降，并且大黄鱼品质下降，食品安全没有保障，鱼的健康 和其免疫力的提高对养殖业而言就尤为重要。益生菌是一类通过改善宿主动物 肠道微生态而对其产生有益影响的微生物饲料添加成分，对宿主动物健康存在 有益影响的微生物。益生菌类产品对动物大都具有提高动物生产性能，增进健 康，改善肠道微生态，提高免疫力等功效。

目前，传统的大黄鱼饲料存在生长速度缓慢，生病率高，免疫力和品质差， 成活率低，食品安全没有保障的问题。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种大黄鱼植物乳杆菌饲料配方及其制备方 法，旨在解决目前，传统的大黄鱼饲料存在生长速度缓慢，生病率高，免疫力 和品质差，成活率低，食品安全没有保障的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种大黄鱼植物乳杆菌饲料配方，该大黄鱼 植物乳杆菌饲料配方包括：植物乳杆菌1×106cfu/kg、菌体0.1g/kg、牛奶9.999 g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、 虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg 组成的喂养饲料和粗蛋白、粗脂、灰分和水分组成的基础饲料；

按照质量百分比，喂养饲料为25.2％，粗蛋白47.3％、粗脂8.9％、灰分10.2％、 水分8.4％。

进一步，该大黄鱼植物乳杆菌饲料配方为：植物乳杆菌1×108cfu/kg、菌体0.1 g/kg、牛奶9.99g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、 鱼油20g/kg、虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素 混合物7g/kg、粗蛋白47.3％、粗脂8.9％、灰分10.2％、水分8.4％。

进一步，该大黄鱼植物乳杆菌饲料配方为：植物乳杆菌1×1010cfu/kg、菌体 10g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、 虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg、 粗蛋白47.3％、粗脂8.9％、灰分10.2％、水分8.4％。

本发明实施例的另一目的在于提供一种大黄鱼植物乳杆菌饲料的制备方 法，该大黄鱼植物乳杆菌饲料的制备方法包括以下步骤：

从韩国腌白菜分离得到植物乳杆菌，37℃培养于含MRS肉汤的无菌烧瓶 中，24小时后，15400×g离心5分钟，收集植物乳杆菌混合物；

按1：4比例与脱脂牛奶混合，冷冻干燥，通过MRS琼脂平板记数测定植 物乳杆菌混合物的生活力；

按照植物乳杆菌1×106cfu/kg、菌体0.001g/kg、牛奶9.999g/kg、鱼粉540 g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、虾壳粉64g/kg、 脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg配置大黄鱼喂养 饲料；

加入成分为47.3％粗蛋白、8.9％粗脂、10.2％灰分和8.4％水分的基础饲料， 混合制成大黄鱼植物乳杆菌饲料。

进一步，该大黄鱼植物乳杆菌饲料一天喂养大黄鱼两次。

本发明提供的大黄鱼植物乳杆菌饲料配方及其制备方法，采用含量为 106-1010cfu/kg植物乳杆菌的配方饲料，促进了大黄鱼的体重增长率和摄食率， 并增强对病菌Streptococcussp的抵抗力，促进了大黄鱼非特异性免疫性能的补 体活性、溶菌酶活性、吞噬活性和头肾白细胞呼吸性。本发明有利于大黄鱼的 养殖业发展。大黄鱼的植物乳杆菌饲料的制备方法简单，大黄鱼生长速度快， 免疫力强，生病和死亡率低，食用安全性好。

附图说明

图1是本发明实施例提供的大黄鱼植物乳杆菌饲料的制备方法流程图；

图2是本发明实施例提供的大黄鱼喂食含0、1×104、1×106、1×108和1×1010cfu/kg植物乳杆菌饲料1-4周的体重增长率示意图；

图3是本发明实施例提供的大黄鱼喂食含0、1×104、1×106、1×108和1×1010cfu/kg植物乳杆菌饲料1-4周的喂食效率示意图；

图4是本发明实施例提供的大黄鱼喂食表一中饲料四周后PCR鉴定示意 图；

图5是本发明实施例提供的大黄鱼喂食含植物乳杆菌饲料1-4周的补体活 性(ACH50)示意图；

图6是本发明实施例提供的大黄鱼喂食含植物乳杆菌、饲料1-4周的头肾 白细胞爆发呼吸力示意图；

图7是本发明实施例提供的大黄鱼喂食含植物乳杆菌饲料1-4周的头肾白 细胞吞噬活性示意图；

图8是本发明实施例提供的黄鱼喂食含植物乳杆菌饲料1-4周的血清溶菌 酶活性(ACH50)示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例， 对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以 解释本发明，并不用于限定本发明。

下面结合附图及具体实施例对本发明的应用原理作进一步描述。

本发明实施例的大黄鱼植物乳杆菌饲料配方：植物乳杆菌1×106cfu/kg、菌 体0.1g/kg、牛奶9.999g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋 20g/kg、鱼油20g/kg、虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、 维生素混合物7g/kg组成的喂养饲料和粗蛋白、粗脂、灰分和水分组成的基础 饲料；

按照质量百分比，喂养饲料为25.2％，粗蛋白47.3％、粗脂8.9％、灰分10.2％、 水分8.4％。

本发明的配方还可以为：植物乳杆菌1×108cfu/kg、菌体0.1g/kg、牛奶9.999 g/kg、鱼粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、 虾壳粉64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg、 粗蛋白47.3％、粗脂8.9％、灰分10.2％、水分8.4％；

本发明的配方还可以为：植物乳杆菌1×1010cfu/kg、菌体10g/kg、鱼粉540 g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、虾壳粉64g/kg、 脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg、粗蛋白47.3％、 粗脂8.9％、灰分10.2％、水分8.4％；

如图1所示，本发明实施例的大黄鱼植物乳杆菌饲料的制备方法包括以下 步骤：

S101：从韩国腌白菜分离得到植物乳杆菌，37℃培养于含MRS肉汤的无 菌烧瓶中，24小时后，15400×g离心5分钟，收集植物乳杆菌混合物；

S102：按1：4比例与脱脂牛奶混合，冷冻干燥，通过MRS琼脂平板记数 测定植物乳杆菌混合物的生活力；

S103：按照植物乳杆菌1×106cfu/kg、菌体0.001g/kg、牛奶9.999g/kg、鱼 粉540g/kg、淀粉183g/kg、鱼膏37g/kg、面筋20g/kg、鱼油20g/kg、虾壳粉 64g/kg、脱脂豆粕94g/kg、矿物混合物35g/kg、维生素混合物7g/kg配置大 黄鱼喂养饲料；

S104：加入成分为47.3％粗蛋白、8.9％粗脂、10.2％灰分和8.4％水分的基 础饲料，混合制成大黄鱼植物乳杆菌饲料。

结合以下具体的实施例对本发明的使用效果做进一步的说明：

实施例1：

1材料与方法：

1.1植物乳杆菌混合物饲料的制备：

植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13从韩国腌白菜分离得到[2]，37℃ 培养于含MRS肉汤的无菌烧瓶中，24小时后，15,400×g离心5分钟，收集植 物乳杆菌混合物，按1：4比例与脱脂牛奶混合，冷冻干燥，通过MRS琼脂平 板记数测定植物乳杆菌混合物的生活力，如表1所示，依据植物乳杆菌含量配 置5种大黄鱼喂养饲料，其中基础饲料成分为47.3％粗蛋白、8.9％粗脂、10.2％ 灰分和8.4％水分，1.0×109cfu/g的植物乳杆菌混合物按表1所示的比例加入到 基础饲料中，使大黄鱼喂养饲料中Saccharomyces cerevisiaeP13植物乳杆菌的 含量分别达到0、104、106、108、1010cfu/kg；

1.2大黄鱼饲养：

大黄鱼幼鱼购自当地一人工养殖场，采用水缸流水(海水)饲养方式在室 内进行饲养实验，实验过程中，每天更换25-35％的海水以保证水的质量，水温 保持在27.0±0.5℃，水的pH值为7.4-8.5，水的盐度保持在3.0±0.2％，所有 实验鱼每天用含植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13配方饲料(表1)喂养 两次，每一配方饲料平行喂养三组实验鱼，共15组，每组5条大黄鱼幼鱼；

1.3大黄鱼生长的测定：

将大黄鱼幼苗随机分成15组，每组于40-60升体积玻璃水族箱中用含有植 物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13的饲料或对照饲料喂养，所有水族箱配 备空气过滤器，在生长测定过程中，大黄鱼每日喂食含植物乳杆菌0，104，106， 108和1010cfu/kg饲料，每星期称重一次直到测定实验结束，体重增加百分率 (PWG)和饲料转化效率(FE)的计算公式如下：PWG＝[100％×(最后体重- 初始体重)/(初始体重)]和FE＝(最后重量-初始体重)/(摄食量)；

1.4大黄鱼抵抗病菌体分析：

大黄鱼喂食含0、104、106、108和1010cfu/kg植物乳杆菌Saccharomyces  cerevisiaeP13的饲料四周后，分别肌肉注射相应量的Streptococcussp.菌体储存 夜(5.0×1010cfu/ml),以使每一实验鱼体内初始Streptococcussp.的浓度为 5.0×105cfu/克鱼体重，所有实验鱼均继续喂食含0、104、106、108和1010cfu/kg 植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13的饲料，每天统计死鱼数；

1.5大黄鱼肠道内SaccharomycescerevisiaeP13的存活分析：

大黄鱼喂食实验用配方饲料四周后，剪取小段新鲜肠子，立即用20ml肉 汤粉碎，37℃过夜培养，4℃，10,000×g离心20分钟，收集沉淀，用购自碧云 天的基因组抽提试剂盒分离纯化SaccharomycescerevisiaeP13基因组DNA，用 SaccharomycescerevisiaeP13特异的引物对 5’-TCTGTATATTCTGTATCTATGTTCCTGC-3’和 5’-AAATGGCCTATTGTATTGTCAGGTC-3’ABI公司的Perkin-Elmer9700核酸 扩增仪上进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，先94℃加热变性10分钟，接着 95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸45秒，35个循环，最后72℃延 伸10分钟，PCR产物用2.0％琼脂糖电泳分离鉴定；

2结果与分析：

2.1SaccharomycescerevisiaeP13对大黄鱼体重增长率的影响：

喂食含植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13的配方饲料(表1)后的大 黄鱼从第一周起，体重增长率便明显高于喂食基础饲料(对照饲料)的大黄鱼 体重增长率，四周后，喂食对照饲料和含1×104、1×106、1×108和1×1010cfu/kg 植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13的大黄鱼体重增长率分别为 88.9±3.1％、101.1±5.8％、132.4±11％、140.8±6.7％和138.9±6.4％(图2)；图2 中大黄鱼喂食含0、1×104、1×106、1×108和1×1010cfu/kg植物乳杆菌 SaccharomycescerevisiaeP13饲料1-4周的体重增长率。每个数值等于每组3次 测定值的平均值加上标准误差，p﹤0.05；

表1大黄鱼喂养饲料成分

2.2SaccharomycescerevisiaeP13提高大黄鱼的喂食效率：

大黄鱼体重增长率的提高一方面可能来自于摄食量的增加，另一方面可能 来自于喂食效率的提高，而最终归结于大黄鱼体内蛋白质转化率的提高，如图 2所示，喂食对照饲料和含1×104、1×106、1×108和1×1010cfu/kg植物乳杆菌 SaccharomycescerevisiaeP13饲料的大黄鱼的喂食效率分别是0.81±0.23、 0.98±0.15、1.10±0.12、1.29±0.24和1.31±0.26，说明大黄鱼的喂食效率随饲料 中植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13含量的增加而提高，从而提高饲料 的实际使用效率；图3大黄鱼喂食含0、1×104、1×106、1×108和1×1010cfu/kg 植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13饲料1-4周的喂食效率，每个数值等 于每组3次测定值的平均值加上标准误差，p﹤0.05；

2.3SaccharomycescerevisiaeP13提高大黄鱼感染.后的存活率：

植物乳杆菌能增强石斑鱼对Streptococcussp.感染的抵抗力，分析了喂食含 植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13的大黄鱼对常见病菌体感染的抵抗力， 喂食对照饲料和含1×104、1×106、1×108和1×1010cfu/kg植物乳杆菌 SaccharomycescerevisiaeP13的大黄鱼在受到病菌体Streptococcussp.感染四周 后的存活率分别是35.7±6.7％、80.0±5.8％、76.7±3.3％、70.0±5.8％和70.0±5.8％ (表2)，说明含植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13的饲料不仅有利于大 黄鱼的生长，同时也有利于大黄鱼对病菌感染的抵抗力；

表2大黄鱼喂食含Saccharomyces cerevisiae P13饲料 的大黄鱼感染Streptococcus sp.后的存活率

2.4大黄鱼喂食后SaccharomycescerevisiaeP13的检测：

大黄鱼喂食含0、1×104、1×106、1×108和1×1010cfu/kg植物乳杆菌 SaccharomycescerevisiaeP13的饲料四周后，通过PCR能特异性地扩增到 SaccharomycescerevisiaeP13基因片段，且PCR产物的量随饲料中 SaccharomycescerevisiaeP13含量的提高而增加(图4)；

益生菌是一类通过改善宿主动物肠道微生态而对动物生长发育以及免疫产 生有益影响的微生物饲料添加成分，益生菌或益生菌发酵产物能有效地促进虹 鳟、石斑鱼等的生长，并增强鱼类对常见病菌体感染的抵抗，本发明通过测定 大黄鱼的体重增长率、喂食效率以及对常见病原菌的抵抗力，研究了益生菌 SaccharomycescerevisiaeP13对大黄鱼生长的影响，结果显示喂食含有 SaccharomycescerevisiaeP13饲料的大黄鱼的生长率、喂食饲料的利用率以及对 病菌的抵抗力都得到了明显提高，表明含SaccharomycescerevisiaeP13的生物 饲料对大黄鱼养殖具有较大的潜在价值。

实施例2：

1材料与方法：

1.1大黄鱼饲养：

大黄鱼幼鱼购自当地一人工养殖场，于室内采用水缸流水(海水)饲养方 式进行饲养实验，实验过程中，每天更换30％的海水以保证水的质量，水温保 持在28±0.2℃，水的pH值为7.5-8.4，水的盐度保持在2.0±0.1％，植物乳杆菌 SaccharomycescerevisiaeP13从韩国腌白菜分离得到，37℃培养于含MRS肉汤 的无菌烧瓶中，24小时后，15,400×g离心5分钟，收集植物乳杆菌混合物， 按1：4比例与脱脂牛奶混合，冷冻干燥，通过MRS琼脂平板记数测定植物乳 杆菌混合物的生活力，所有实验鱼每天用按表一配制的配方饲料或基础饲料喂 养两次，每一配方饲料喂养三个平行组实验鱼，共15组，每组5条大黄鱼幼鱼， 大黄鱼喂食含有乳酸菌SaccharomycescerevisiaeP13的饲料四周后，分别测定 相关免疫参数；

1.2补体活性(ACH50)的测定：

测定补体活性，用绵羊红血细胞作为靶细胞，用EGTA-Mg2+-GVB缓冲液 按比例稀释来自大黄鱼的血液样本，各取20μl作为补体来源，与6μl绵羊红 血细胞悬浮液混匀，21℃，pH7.2孵育2小时，加入200μl含EDTA的GVB 缓冲液终止溶血反应，4℃，1600×g离心10分钟，用酶联免疫吸附法(ELISA) 测上清液的OD值，溶血反应液中分别用6μlEDTA-GVB，20μLEDTA-GVB 改变，200μl去离子水取代绵羊红血细胞悬液、稀释大黄鱼血样本以及稀释血 样本/EDTA-GVB，作为SRBC、血样本和100％溶血样本的空白对照，溶血度 按以下公式计算：

1.3溶酶活性测定：

血清溶酶活性按照文献报道方法测定[3]，10μl血清样本与200μl溶解于 pH6.2的PBS(0.05M)的Micrococcusluteus悬浮液混合，27℃温育6分钟，用 ELISA读板在530nm测其OD值，每毫升血样每分钟降低0.001OD值定义为 一单位溶酶活性；

1.4爆发呼吸测定：

大黄鱼头肾白细胞爆发呼吸活性方法测定，用0.20％的聚L-lysine溶液预 包埋微量板(100μl/孔)，随后每孔加入100μl白细胞悬液(1×106细胞/毫升)， 700×g离心20分钟，除去未贴壁的细胞，用HBSS液清洗微量板孔，每孔加入 含0.1％酵母多糖的HBSS液，室温反应30分钟，单独加入100μlHBSS液的 孔位空白对照，用HBSS液洗细胞3次，加入100μl0.3％NBT液，室温染色 30分钟，除去NBT液，并加入100μl甲醇终止染色反应，加入120μlKOH(2.0 M)和140μlDMSO，用ELISA读板仪测定每孔细胞裂解液的OD值，每个测 定平行做3次；

1.5吞噬活性的测定：

往12孔板中每孔加入500μl含1×106个头肾白细胞的L-15液，4℃于400×g 离心20分钟，除去非贴壁细胞，并用L-15液清洗细胞，每孔加入1μl含1×106荧光乳胶珠的液，28℃温育2小时，用PBS液洗细胞3次，以除去未被吸附的 荧光乳胶珠，用10％福尔马林固定后，用PBS洗3次，用0.1％碘化丙啶染色 10min，再用PBS洗3次，在荧光显微镜下挑选100个吞噬细胞以计算摄取有 孔玻璃珠的吞噬细胞的百分比；

2结果与分析：

2.1植物乳杆菌提高大黄鱼补体活性(ACH50)：

喂食含有植物乳杆菌(SaccharomycescerevisiaeP13)1×106、1×108和1×1010cfu/kg饲料的大黄鱼ACH50明显高于喂食含有植物乳杆菌1×104或对照饲料的 大黄鱼ACH50，比对照组大黄鱼的ACH50分别高出32±7％、103±15％、158±20％ 和168±11％(图5)；图5中大黄鱼喂食含植物乳杆菌Saccharomycescerevisiae P13饲料1-4周的补体活性(ACH50)，每个数值等于每组3次测定值的平均值 加上标准误差，p﹤0.05。

2.2植物乳杆菌提高大黄鱼白细胞爆发性呼吸力以及吞噬能力：

爆发性呼吸时由吞噬细胞攻击入侵病原体时产生的，常用于评价机体对病 原体的防疫能力；益生菌能改进虹鳟等鱼类血细胞爆发呼吸力以及头肾白细胞 的吞噬性。本发明结果显示喂食含有植物乳杆菌(SaccharomycescerevisiaeP13) 的饲料四周后，大黄鱼头肾白细胞爆发性呼吸力以及吞噬能力都明显高于喂食 对照饲料的大黄鱼(图6和图7)；图6中大黄鱼喂食含植物乳杆菌Saccharomyces  cerevisiaeP13饲料1-4周的头肾白细胞爆发呼吸力。每个数值等于每组3次测 定值的平均值加上标准误差，p﹤0.05。图7中大黄鱼喂食含植物乳杆菌 SaccharomycescerevisiaeP13饲料1-4周的头肾白细胞吞噬活性。每个数值等于 每组3次测定值的平均值加上标准误差。p﹤0.05。

2.3植物乳杆菌提高大黄鱼溶菌酶活性：

机体一方面通过免疫细胞抵抗外来异物的入侵，同时也借助不补提分子和 系列溶菌酶来增强机体对病原体的防御。本发明中，喂食植物乳杆菌104、106、 108和1010cfu/kg的大黄鱼溶菌酶活性比对照组有了显著提高(图8)，图8中 大黄鱼喂食含植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13饲料1-4周的血清溶菌 酶活性(ACH50)。每个数值等于每组3次测定值的平均值加上标准误差。P﹤ 0.05。

本发明通过给大黄鱼喂食含有植物乳杆菌0、1×104、1×106、1×108和1×1010cfu/kg的饲料(表1)四周后，分别测定反映大黄鱼天然免疫活性的免疫参数。 综合研究结果表明，植物乳杆菌SaccharomycescerevisiaeP13可通过改进大黄 鱼的头肾细胞爆发呼吸力、吞噬活力、补体活力以及血清溶菌酶活性，而增强 大黄鱼的天然免疫系统，这为大黄鱼养殖用生物饲料的研发提供了有力的实验 理论依据，促进大黄鱼养殖业的健康发展。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

本文标签： 大黄鱼杆菌配方饲料制备方法