一种新型缓释高效纳米广谱杀菌剂及其制备方法、应用

admin管理员组

文章数量:866648

本发明属于农药技术领域，具体涉及一种新型缓释高效纳米广谱杀菌剂及其制备方法、应用，该杀菌剂通过聚γ‑谷氨酸、壳寡糖及异噻唑啉酮类杀菌剂制备而成的纳米颗粒。本发明制备的聚γ‑谷氨酸/壳寡糖/异噻唑啉酮类杀菌剂灭菌抑菌效果好，对MIT负载率高，缓释效果好，具有良好的可降解性能，环保性能好。本发明通过聚γ‑谷氨酸、壳寡糖及异噻唑啉酮类杀菌剂协同配合作用，能够有效的提高杀菌抑菌效果，延长药物作用时间，降低微生物等的耐药性。

1.一种新型缓释高效纳米广谱杀菌剂，其特征在于，该杀菌剂通过聚γ-谷氨酸、壳寡糖及异噻唑啉酮类杀菌剂制备而成的纳米颗粒。 2.根据权利要求1所述的新型缓释高效纳米广谱杀菌剂，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为80～100nm。 3.一种如权利要求1或2所述的新型缓释高效纳米广谱杀菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1）配制浓度为120-160mg/mL聚γ-谷氨酸透明溶液，搅拌均匀；2）配制12mg/mL壳寡糖溶液，搅拌均匀，按照体积比1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸溶液中，搅拌后微波加热至沸腾，搅拌冷却至室温，得聚γ-谷氨酸/壳寡糖溶液；3）配制1MEDC/NHS溶液，按体积比1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖溶液内，磁力搅拌器搅拌3h，得到均质的混合基质溶液；4）取质量浓度为14%的MIT溶液加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖混合基质溶液中，搅拌均匀得溶液；5）加入药物后的溶液，磁力搅拌器搅拌2h后，置于超声容器内，超声8h后，将超声后的溶液，冷冻干燥后，制备粉末聚γ-谷氨酸/壳寡糖/异噻唑啉酮类杀菌剂。 4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述EDC/NHS溶液中EDC和NHS的摩尔比为2：1。 5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述γ-PGA与MIT质量比为30～40:1。 6.一种如权利要求3-5任一项所述的制备方法制备的杀菌剂在农业中杀菌抑菌方面的应用。

技术领域

本发明属于农药技术领域，具体涉及一种新型缓释高效纳米广谱杀菌剂及其制备方法、应用。

背景技术

我国是常用的农药大国之一，大量对有机农药、杀虫剂、多种抗菌灵药物的使用，带来了严重的农药残留问题，严重污染环境，并损害人们的身体健康。常见的农药保护剂，大多为化学合成的高分子化合物，存在难降解，缓释性能差，成本高等一系列的问题，为此，限制了农药在这些方面的研究和使用。

聚γ-谷氨酸为微生物所产生的次级代谢产物-高分子聚阳离子复合物，具有易降解性、易吸水性、易溶解性，无毒、环保型的多种性能。现有技术中，异噻唑啉酮类杀菌剂仅仅通过物理性的原料复配，能够缓解微生物等的耐药性问题，但是，降解、缓释等问题仍制约着该类杀菌剂的发展。因此，寻求一种新的异噻唑啉酮类杀菌剂成为了亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新型缓释高效纳米广谱杀菌剂。

本发明还提供了一种新型缓释高效纳米广谱杀菌剂的制备方法。

本发明还提供了一种上述制备方法制备的新型缓释高效纳米广谱杀菌剂在农业方面的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种新型缓释高效纳米广谱杀菌剂，该杀菌剂通过聚γ-谷氨酸、壳寡糖及异噻唑啉酮类杀菌剂制备而成的纳米颗粒。

本发明制备的杀菌剂纳米颗粒的粒径为80～100 nm。

本发明还提供了一种上述新型缓释高效纳米广谱杀菌剂的制备方法，包括以下步骤：

1）配制浓度为120-160 mg/mL聚γ-谷氨酸透明溶液，搅拌均匀；

2）配制12 mg/mL 壳寡糖溶液，搅拌均匀，按照体积比1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸溶液中，搅拌后微波加热至沸腾，搅拌冷却至室温，得聚γ-谷氨酸/壳寡糖溶液；

3）配制1 M EDC/NHS溶液，按体积比1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖溶液内，磁力搅拌器搅拌3 h，得到均质的混合基质溶液；

4） 取质量浓度为14%的MIT溶液加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖混合基质溶液中，搅拌均匀得溶液；

5）加入药物后的溶液，磁力搅拌器搅拌2 h后，置于超声容器内，超声8 h后，将超声后的溶液，冷冻干燥后，制备粉末聚γ-谷氨酸/壳寡糖/异噻唑啉酮类杀菌剂。

进一步的，所述EDC/NHS溶液中EDC和NHS的摩尔比为2：1。

进一步的，所述γ-PGA与MIT质量比为30～40:1。

本发明还提供了一种利用上述制备方法制备的杀菌剂在农业中杀菌抑菌方面的应用。

本发明通过γ-PGA，壳寡糖，活化剂EDC/NHS构建基质溶液，包埋一定浓度的药物MIT，经过搅拌和超声处理，制备出新型农业缓释高效纳米广谱杀菌剂。

本发明的有益效果为：

（1）本发明制备的聚γ-谷氨酸/壳寡糖/异噻唑啉酮类杀菌剂灭菌抑菌效果好，对MIT负载率高，缓释效果好，具有良好的可降解性能，环保性能好。

（2）本发明通过聚γ-谷氨酸、壳寡糖及异噻唑啉酮类杀菌剂协同配合作用，能够有效的提高杀菌抑菌效果，延长药物作用时间，降低微生物等的耐药性。

具体实施方式

下面结合具体实施方案，来进一步阐述本发明。并认为，这些实施例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。

实施例1

于聚γ-谷氨酸：壳寡糖：EDC/NHS浓度比为7.5：1:0.5条件下制备纳米广谱杀菌剂

步骤1 高效纳米广谱杀菌剂的制备

1）于5 mL体系中配制浓度为120 mg/mL聚γ-谷氨酸透明溶液，搅拌均匀；

2）于5 mL体系中配制12 mg/mL 壳寡糖溶液，搅拌均匀，按照1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸溶液中，搅拌后微波炉加热至沸腾，搅拌冷却至室温，其中聚γ-谷氨酸与壳寡糖浓度比为7.5:1；

3）按照摩尔比为2:1的比例配制1 M EDC/NHS溶液，按1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖溶液内，磁力搅拌器搅拌3 h，得到均质的混合基质溶液，其中聚γ-谷氨酸与壳寡糖，EDC/NHS浓度比为7.5:1:0.5；

4） 取浓度为14%的MIT溶液0.144 mL加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖基质溶液，使20 mL的体系中MIT浓度为0.1%；

5）加入药物后的溶液，磁力搅拌器搅拌2 h后，置于超声容器内，超声8 h后，将超声后的溶液，冷冻干燥后，制备成抗菌剂粉末，为防止吸水变潮，密封保存。

步骤2 高效液相色谱法测定异噻唑啉酮（MIT）含量

仪器：安捷伦1260Ⅱ，紫外可见光检测器；色谱柱：EC—C18；流动相：甲醇：水=35:65（v:v）；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；实验组：制备好的纳米抗菌剂过滤液；设置空白对照组：MIT药物浓度为0.1%的溶液。

步骤3 抑菌效果的检测

制备平板固体LB培养基，平板表面均匀涂布100 μL大肠杆菌和金黄色葡萄菌；取牛津杯（d=8 mm）置于涂布好的LB平板上，里面加入200 μL制备好的纳米抗菌剂溶液，对照组为浓度0.1%药物溶液；于37℃恒温培养箱中培养72 h后观察抑菌结果（通过透明圈的大小来衡量抑菌效果）。

结果如表1和表2所示，聚γ-谷氨酸：壳寡糖：EDC/NHS浓度比为7.5:1:1条件下制备的负载MIT药物的纳米抗菌剂，经检测其纳米颗粒大小在50～100 nm之间，与对照组相比，随着时间的延长，到72 h后，药物的负载率仍能够达到42.7%，其作用时间能够维持三天，说明能够负载大量的药物并明显延长药物的作用时间，减少后续药物的再次使用；该药物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显的抑菌效果，其透明圈比较接近对照组透明圈的大小，抑菌效果良好，对革兰氏阳性与阴性菌的抑菌效果超过。

表1

表2

实施例2

于聚γ-谷氨酸：壳寡糖：EDC/NHS浓度比为10：1:0.5条件下制备纳米广谱杀菌剂

步骤1 高效纳米广谱杀菌剂的制备

1）于5 mL体系中配制浓度为160 mg/mL聚γ-谷氨酸透明溶液，搅拌均匀；

2）于5 mL体系中配制12 mg/mL 壳寡糖溶液，搅拌均匀，按照1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸溶液中，搅拌后微波炉加热至沸腾，搅拌冷却至室温，其中聚γ-谷氨酸与壳寡糖浓度比为10:1；

3）按照摩尔比为2:1的比例配制1 M EDC/NHS溶液，按1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖溶液内，磁力搅拌器搅拌3 h，得到均质的混合基质溶液，其中聚γ-谷氨酸与壳寡糖，EDC/NHS浓度比为10:1:0.5；

4） 取浓度为14%的MIT溶液0.144 mL加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖基质溶液，使20 mL的体系中MIT浓度为0.1%；

5）加入药物后的溶液，磁力搅拌器搅拌2 h后，置于超声容器内，超声8 h后，将超声后的溶液，冷冻干燥后，制备成抗菌剂粉末，为防止吸水变潮，密封保存。

步骤2 高效液相色谱法测定异噻唑啉酮（MIT）含量

仪器：安捷伦1260Ⅱ，紫外可见光检测器；色谱柱：EC—C18；流动相：甲醇：水=35:65（v:v）；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；实验组：制备好的纳米抗菌剂过滤液；设置空白对照组：MIT药物浓度为0.1%的溶液。

步骤3 抑菌效果的检测

制备平板固体LB培养基，平板表面均匀涂布100 μL大肠杆菌和金黄色葡萄菌；取牛津杯（d=8 mm）置于涂布好的LB平板上，里面加入200 μL制备好的纳米抗菌剂溶液，对照组为浓度0.1%药物溶液；于37℃恒温培养箱中培养72 h后观察抑菌结果（通过透明圈的大小来衡量抑菌效果）。

结果如表3和表4所示，聚γ-谷氨酸：壳寡糖：EDC/NHS浓度比为10:1:0.5条件下制备的负载MIT药物的纳米抗菌剂，经检测其纳米颗粒大小在40～80 nm之间，与对照组相比，随着时间的延长，到72 h后，药物的负载率仍能够达到50.0%，其作用时间能够维持三天，说明能够负载大量的药物并明显延长药物的作用时间，减少后续药物的再次使用；该药物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显的抑菌效果，其透明圈比较接近对照组透明圈的大小，抑菌效果良好，对革兰氏阳性与阴性菌的抑菌效果超过。

表3

表4

实施例3 于聚γ-谷氨酸：壳寡糖：EDC/NHS浓度比为12.5:1:0.5条件下制备纳米广谱杀菌剂

步骤1 高效纳米广谱杀菌剂的制备

1）于5 mL体系中配制浓度为200 mg/mL聚γ-谷氨酸透明溶液，搅拌均匀；

2）于5 mL体系中配制12 mg/mL 壳寡糖溶液，搅拌均匀，按照1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸溶液中，搅拌后微波炉加热至沸腾，搅拌冷却至室温，其中聚γ-谷氨酸与壳寡糖浓度比为12.5:1；

3）按照摩尔比为2:1的比例配制1 M EDC/NHS溶液，按1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖溶液内，磁力搅拌器搅拌3 h，得到均质的混合基质溶液，其中聚γ-谷氨酸与壳寡糖，EDC/NHS浓度比为12.5:1:0.5；

4） 取浓度为14%的MIT溶液0.144 mL加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖基质溶液，使20 mL的体系中MIT浓度为0.1%；

5）加入药物后的溶液，磁力搅拌器搅拌2 h后，置于超声容器内，超声8 h后，将超声后的溶液，冷冻干燥后，制备成抗菌剂粉末，为防止吸水变潮，密封保存。

步骤2 高效液相色谱法测定异噻唑啉酮（MIT）含量

仪器：安捷伦1260Ⅱ，紫外可见光检测器；色谱柱：EC—C18；流动相：甲醇：水=35:65（v:v）；流速：1 mL/min；检测波长：254 nm；柱温：30 ℃；进样体积：10 μL；实验组：制备好的纳米抗菌剂过滤液；设置空白对照组：MIT药物浓度为0.1%的溶液。

步骤3 抑菌效果的检测

制备平板固体LB培养基，平板表面均匀涂布100 μL大肠杆菌和金黄色葡萄菌；取牛津杯（d=8 mm）置于涂布好的LB平板上，里面加入200 μL制备好的纳米抗菌剂溶液，对照组为浓度0.1%药物溶液；于37℃恒温培养箱中培养72 h后观察抑菌结果（通过透明圈的大小来衡量抑菌效果）。

结果如表5和表6所示，聚γ-谷氨酸：壳寡糖：EDC/NHS浓度比为12.5:1:1条件下制备的负载MIT药物的纳米抗菌剂，经检测其纳米颗粒大小在150～300 nm之间，与对照组相比，随着时间的延长，到72 h后，药物的负载率仍能够达到39.0%，作用时间能够维持三天，说明能够负载大量的药物并明显延长药物的作用时间，减少后续药物的再次使用；该药物对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌有明显的抑菌效果，其透明圈比较接近对照组透明圈的大小，抑菌效果良好，对革兰氏阳性与阴性菌的抑菌效果超过。

表5

表6

对比例1

与实施例2不同之处在于，控制聚γ-谷氨酸的浓度为160 mg/mL在不添加壳寡糖的基础上进行后续的试验操作，聚γ-谷氨酸与MIT药物浓度之比为40:1，其它条件不变，制备了聚γ-谷氨酸/MIT纳米抗菌剂，对纳米抗菌剂颗粒粒径的大小，MIT药物的负载率以及抗菌效果进行检测。

对比例1结果显示，无壳寡糖存在的条件下，制备的纳米抗菌剂，其纳米颗粒粒径大小在250～300 nm左右；MIT药物的负载率在72 h后维持在19.8%，远低于实施例2中的缓释效果。；对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为12.3 mm和10.8 mm。

对比例2

与实施例2不同之处在于，控制壳寡糖的浓度为12 mg/mL，在不添加聚γ-谷氨酸的基础上进行后续的试验操作，壳寡糖与MIT药物浓度之比为4:1，其它条件不变，制备了壳寡糖/MIT纳米抗菌剂，对纳米抗菌剂颗粒粒径的大小，MIT药物的负载率以及抗菌效果进行检测。

对比例2结果显示，无聚γ-谷氨酸存在的条件下，制备的纳米抗菌剂，其纳米颗粒粒径大小在100～200 nm左右；MIT药物的负载率在72 h后维持在20.3%左右，远低于实施例2中负载率；对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别达11.6 mm和10.5 mm，仍具有一定的抑菌抗菌效果，但较本发明实施例效果差。

对比例3

与实施例2不同之处在于，控制聚γ-谷氨酸浓度为160 mg/mL，壳寡糖的浓度为12 mg/mL，聚γ-谷氨酸与壳寡糖浓度比为10:1，在不添加活化剂EDC/NHS的基础上，其它条件不变，制备了聚γ-谷氨酸/壳寡糖/MIT纳米抗菌剂，对纳米抗菌剂颗粒粒径的大小，MIT药物的负载率以及抗菌效果进行检测。

对比例3结果显示，无活化剂EDC/NHS存在的条件下，制备的纳米抗菌剂，其纳米颗粒粒径大小在50～100 nm左右，纳米颗粒粒径较小；MIT药物的负载率在72 h后维持在23.4%左右，远低于实施例2中负载率，效果较差；对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别达11.4 mm和10.7 mm，仍具有一定的抑菌抗菌效果，但是抑菌效果较差，远低于实施例2中的抑菌效果。

对比例4

步骤1 高效纳米广谱杀菌剂的制备

1）于5 mL体系中配制浓度为120 mg/mL聚γ-谷氨酸透明溶液，搅拌均匀；

2）取浓度为14%的MIT溶液0.144 mL加入到制备好的聚γ-谷氨酸透明溶液中，得混合溶液，于5 mL体系中配制12 mg/mL 壳寡糖溶液，搅拌均匀，按照1:1比例加入到混合溶液中，搅拌后微波炉加热至沸腾，搅拌冷却至室温；

3）按照摩尔比为2:1的比例配制1 M EDC/NHS溶液，按1:1比例加入到制备好的聚γ-谷氨酸/壳寡糖溶液内，磁力搅拌器搅拌2 h后，置于超声容器内，超声8 h后，将超声后的溶液，冷冻干燥后，制备成抗菌剂粉末，为防止吸水变潮，密封保存。

对比例4结果显示，制备的纳米抗菌剂，其纳米颗粒粒径大小在300-400 nm左右，纳米颗粒粒径大；MIT药物的负载率在72 h后维持在15.1%左右，远低于实施例1中负载率，效果较差；对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别达12.5 mm和11.6 mm，仍具有一定的抑菌抗菌效果，但是抑菌效果较差，远低于实施例1中的抑菌效果。

本文标签： 杀菌剂高效纳米制备方法广谱