含有2,5哌嗪二酮,3,6双苯基甲基）,3S,6S的酸性提取物和饮料

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本发明提供含有作为具有学习积极性改善作用的有用物质的2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基）-,(3S,6S)-，可用于制造酸性饮料的提取物等。在含有2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基）-,(3S,6S)-的提取物的制造中，通过包括酸处理工序，可得到即使添加到饮料中时也不产生沉淀的酸性提取物。本发明的提取物不损坏饮食物原本的呈味，可添加到饮料等中，可用于被市场喜好的酸性饮料的制造中。

1.一种提取物，其特征在于，含有2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基)-,(3S,6S)-，pH小于5，其中，通过如下工序制备所述提取物:(1)以鸟兽肉类、鱼肉类或贝肉类为原料，通过在液体中加热而除去这些原料中所含有的水溶性蛋白质的预处理工序，其中，所述加热在100℃～160℃下进行；以及(2)在所述预处理后交换液体，再次加热的工序，其中，所述再次加热在100℃以上、1大气压以上进行。 2.根据权利要求1中所述的提取物，其特征在于，2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基)-,(3S,6S)-含量(μg/100g)和白利度(Bx)的比为0.1(μg/100g)/Bx以上。 3.根据权利要求1中所述的提取物，其特征在于，2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基)-,(3S,6S)-含量(μg/100g)和白利度(Bx)的比为6(μg/100g)/Bx以上。 4.根据权利要求1～3中任一项所述的提取物，其特征在于，以1μg/100g以上的浓度含有2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基)-,(3S,6S)-。 5.根据权利要求1～3中任一项所述的提取物，其特征在于，以60μg/100g以上的浓度含有2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基)-,(3S,6S)-。 6.根据权利要求1～3中任一项所述的提取物，其特征在于，所述肉类为鸡肉。 7.根据权利要求4中所述的提取物，其特征在于，所述肉类为鸡肉。 8.根据权利要求5中所述的提取物，其特征在于，所述肉类为鸡肉。 9.一种提取物干燥物，其特征在于，将权利要求1～8中任一项所述的提取物干燥而获得。 10.一种酸性饮料，其特征在于，添加权利要求1～8中任一项所述的提取物而获得。 11.一种酸性饮料，其特征在于，含有2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基)-,(3S,6S)-，pH小于5，其中，通过如下工序制备所述饮料:(1)以鸟兽肉类、鱼肉类或贝肉类为原料，通过在液体中加热而除去这些原料中所含有的水溶性蛋白质的预处理工序，其中，所述加热在100℃～160℃下进行；以及(2)在所述预处理后交换液体，再次加热的工序，其中，所述再次加热在100℃以上、1大气压以上进行。 12.根据权利要求10中所述的酸性饮料，其特征在于，2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基)-,(3S,6S)-含量(μg/100g)和白利度(Bx)的比为0.1(μg/100g)/Bx以上。 13.根据权利要求11中所述的酸性饮料，其特征在于，2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基)-,(3S,6S)-含量(μg/100g)和白利度(Bx)的比为0.1(μg/100g)/Bx以上。 14.根据权利要求10～13中任一项所述的酸性饮料，其特征在于，以1μg/100g以上的浓度含有2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基)-,(3S,6S)-。 15.根据权利要求10～13中任一项所述的酸性饮料，其特征在于，所述饮料中不含有沉淀。 16.根据权利要求14所述的酸性饮料，其特征在于，所述饮料中不含有沉淀。 17.根据权利要求10～13中任一项所述的酸性饮料，其特征在于，所述饮料中含有沉淀，从饮料中回收的每1g沉淀中所含有的蛋白质为0.01mg以下。 18.根据权利要求14所述的酸性饮料，其特征在于，所述饮料中含有沉淀，从饮料中回收的每1g沉淀中所含有的蛋白质为0.01mg以下。 19.一种容器装饮料，其特征在于，装入了权利要求10～18中任一项所述的饮料。 20.一种制造方法，其为权利要求1中所述的提取物的制造方法，其特征在于，包含(1)以鸟兽肉类、鱼肉类或贝肉类为原料，通过在液体中加热而除去这些原料中所含有的水溶性蛋白质的预处理工序，其中，所述加热在100℃～160℃下进行；(2)在所述预处理后交换液体，再次加热的工序，其中，所述再次加热在100℃以上、1大气压以上进行；(3)添加酸的工序；及(4)过滤所得到的液体样品的工序。 21.根据权利要求20中所述的制造方法,其特征在于，所述工序(3)中添加的酸选自磷酸、苹果酸及柠檬酸中的一种以上。 22.一种制造方法，其为权利要求11中所述的饮料的制造方法，其特征在于，包含(1)以鸟兽肉类、鱼肉类或贝肉类为原料，通过在液体中加热而除去这些原料中所含有的水溶性蛋白质的预处理工序，其中，所述加热在100℃～160℃下进行；(2)在所述预处理后交换液体，再次加热的工序，其中，所述再次加热在100℃以上、1大气压以上进行；(3)添加酸的工序；及(4)过滤所得到的液体样品的工序。 23.根据权利要求22中所述的制造方法，其特征在于，所述工序(3)中，添加的酸选自磷酸、苹果酸及柠檬酸中的一种以上。

技术领域

本发明涉及含有2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基）-,(3S,6S)-的酸性饮食品，更详细地说，涉及含有2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基）-,(3S,6S)-的pH小于5的提取物及饮料等。 

背景技术

在高度复杂化的现代社会，积极性降低已成为问题。例如有被称作“动机危机（motivation crisis）”的名词，年轻人的动机（motivation）降低已成为很大的问题。此外，通常多数抑郁症患者都显示出积极性降低症状，所以希望开发出可改善积极性降低的药剂。 

近年来，两个氨基酸结合的“二肽”作为功能性物质而受到注目。二肽可赋予单体氨基酸中不具备的物理性质和新型功能，所以期待具有氨基酸以上应用范围的二肽。本发明者发现作为2,5-二酮哌嗪衍生物的2,5-哌嗪二酮,3,6-双(苯基甲基）-,(3S,6S)-（CA登记号（CA Registry Number）:2862-51-3）（以下称为“化合物A”。）具有学习积极性改善作用（相同日期的专利申请：日本特愿2009－296164公报）。 

可是，市场喜好酸性饮料。另一方面，作为含有化合物A的饮料，作为液体存在将畜肉煮后而获得的鸡肉提取物，作为固形物存在鸡肉汤料（Consomme）等。 

发明内容

但是，鸡肉提取物、鸡肉汤料（Consomme）等的pH为中性。因此，作为含有化合物A的饮料应提供被市场喜好的酸性饮料，将这些中性的提取物等添加到酸性的液体中时，会产生沉淀，同时还具有鸡肉提取物特有的味道·滑腻· 粗糙，无法得到香味上也使人满意的饮料。 

此外，因化合物A几乎不溶于水，所以，无法直接在饮料中简单地添加化合物A。 

因此，本发明的目的在于，提供可用于含有作为具有学习积极性改善作用的有用物质的化合物A的酸性饮料制造的提取物及含有化合物A的酸性饮料。 

本发明者为解决上述课题而进行深入研究，结果可得到含有化合物A同时添加到饮料中时也不产生沉淀的、且香味、口感良好的酸性提取物，从而完成了本发明。 

即本发明为以下［1］～［20］。 

［1］一种提取物，其特征在于，含有化合物A，pH小于5。 

［2］根据［1］中所述的提取物，其特征在于，化合物A含量（μg/100g）和白利度（Bx）的比为0.1（μg/100g）/Bx以上。 

［3］根据［1］中所述的提取物，其特征在于，化合物A含量（μg/100g）和白利度（Bx）的比为6（μg/100g）/Bx以上。 

［4］根据［1］～［3］中任一项所述的提取物，其特征在于，以1μg/100g以上的浓度含有化合物A。 

［5］根据［1］～［3］中任一项所述的提取物，其特征在于，以60μg/100g以上的浓度含有化合物A。 

［6］根据［1］～［5］中任一项所述的提取物，其特征在于，化合物A从天然物中提取。 

根据［6］中所述的提取物，其特征在于，天然物为鸟兽肉类、鱼肉类或贝肉类。 

［8］根据［6］或［7］中所述的提取物，其特征在于，天然物为鸡肉。 

［9］一种提取物干燥物，其特征在于，将［1］～［8］中任一项所述的提取物干燥而获得。 

［10］一种酸性饮料，其特征在于，添加［1］～［8］中任一项所述的提取物而获得。 

［11］一种酸性饮料，其特征在于，含有化合物A，pH小于5。 

［12］根据［10］或［11］中所述的酸性饮料，其特征在于，化合物A含量（μg/100g）和白利度（Bx）的比为0.1（μg/100g）/Bx以上。 

［13］根据［10］～［12］中任一项所述的酸性饮料，其特征在于，以1μg/100g以上的浓度含有化合物A。 

［14］根据［10］～［13］中任一项所述的酸性饮料，其特征在于，所述饮料中不含有沉淀。 

［15］根据［10］～［13］中任一项所述的酸性饮料，其特征在于，所述饮料中含有沉淀，从饮料中回收的每1g沉淀中所含有的蛋白质为0.01mg以下。 

［16］一种容器装饮料，其特征在于，装入了［10］～［15］中任一项所述的饮料。 

［17］一种制造方法，其为［1］中所述的提取物的制造方法，其特征在于，包含 

（1）以鸟兽肉类、鱼肉类或贝肉类为原料，通过在液体中加热而除去这些原料中所含有的水溶性蛋白质的预处理工序； 

（2）在所述预处理后交换液体，再次加热的工序； 

（3）添加酸的工序；及 

（4）过滤所得到的液体样品的工序。 

［18］根据［17］中所述的制造方法,其特征在于，所述工序（3）中添加的酸选自磷酸、苹果酸及柠檬酸中的一种以上。 

［19］一种制造方法，其为［11］中所述的饮料的制造方法，其特征在于，包含 

（1）以鸟兽肉类、鱼肉类或贝肉类为原料，通过在液体中加热而除去这些原料中所含有的水溶性蛋白质的预处理工序； 

（2）在所述预处理后交换液体，再次加热的工序； 

（3）添加酸的工序；及 

（4）过滤所得到的液体样品的工序。 

［20］根据［19］中所述的制造方法，其特征在于，所述工序（3）中，添加的酸选自磷酸、苹果酸及柠檬酸中的一种以上。 

本发明提供含有具有学习积极性改善作用、无副作用且安全性高的化合物A、同时即使添加到饮料中时也不产生沉淀的酸性提取物。本发明的提取物不损坏饮食物原本的呈味，可添加到饮料等中，可用于被市场喜好的酸性饮料的制造中。本发明的酸性提取物或饮料、进一步添加这些的饮食品也可作为对改善学习积极性有用的饮食品而长期持续摄取。 

附图说明

图1表示通过摄取试验样品，小鼠找到逃生平台的时间是否因重复试验而缩短的试验结果。 

图2表示通过摄取试验样品，小鼠找到逃生平台的时间是否因重复试验而缩短的试验结果。 

图3表示通过摄取试验样品，小鼠找到逃生平台的时间是否因重复试验而缩短的试验结果。 

图4表示对使用各种原料而获得的提取物中的化合物A定量的结果。 

具体实施方式

以下对本发明的实施方式进行详细说明。 

＜酸性提取物＞ 

本发明的酸性提取物含有作为具有学习积极性改善作用的有用物质的化合物A，同时在添加到酸性饮料中时也不产生沉淀。 

本发明的酸性提取物在酸性饮料中也无沉淀，可适用。本发明的酸性提取物为如下提取物，可抑制对饮料整体的香味、口感的影响，同时可将化合物A高浓度添加到饮料中的提取物。根据这些特征，可扩大饮料香味设计的自由度。 

本发明的提取物为酸性，在本说明书中酸性指pH小于5。本发明液的pH小于5，优选为4.5以下，进一步优选为4以下。 

此外，本发明的提取物的方式之一为如下提取物，pH小于5、高浓度含有化合物A且化合物A含量（μg/100g）和白利度（Bx）的比为0.1以上，优选为6（μg/100g）/Bx以上的提取物。 

因化合物A是具有学习积极性改善作用的有用物质，所以，优选在提取物中的含量越高越好。具体地说，优选为1μg/100g以上，更优选为60μg/100g以上，进一步优选为75μg/100g以上。但是，白利度高的提取物指高浓度含有来自原料的各种物质（例如苦味成分），这些物质不仅不适合饮料，对香味、口感的影响也很大，大多不适合添加到饮料中。因此，优选提取物的白利度越低越好。且此处所述的Bx可用市售的Bx测定仪计算测量。 

因此，优选大量含有作为有用物质的化合物A且白利度低的提取物，即化合物A的含量（μg/100g）和白利度（Bx）的比值高的提取物。具体地说，优选化合物A含量（μg/100g）和白利度（Bx）的比为0.1（μg/100g）/Bx以上，更优选为6以上，进一步优选为10以上。此种提取物无论是否高含量含有化合物A，但由于Bx相对低，所以向饮料中的配合量少也无妨，具有增加饮料设计的自由度的优点。其结果，可制备外观优异（无沉淀·混浊）、不损坏香味的饮料。 

化合物A的浓度可用各种方法定量，例如可通过高效液相色谱法（HPLC）定量。 

本发明的酸性提取物是液状提取物，可直接饮用，也可添加在饮食品中。且提取物可通过冷冻干燥、冻干等工序容易地制成粉末，且因所得到的提取物粉末为水溶性，所以，可简单地溶于水等液体中饮用。且通过形成粉末形态而容易地添加到各种饮食品中并易被利用。 

还可形成软胶囊或片剂的形态。软胶囊、片剂是包裹本发明提取物、提取物粉末或颗粒的软胶囊、片剂。 

添加提取物或提取物粉末的饮食品的种类和形态无任何限制。能以例如片剂及胶囊剂等的片剂形态的健康食品、酸奶、加工食品、甜点类、小零食（例如口香糖、糖果、果冻）等的固体食品、咖啡、乌龙茶、红茶、清凉饮料、保健饮料等液体饮料等的形态提供。此外，还包含宠物食品、动物用饲料。 

＜酸性饮料＞ 

本发明的饮料为含有化合物A、pH小于5的酸性饮料。此外，本发明的方式之一是如下饮料，含有化合物A、pH小于5且化合物A含量/Bx为0.1（μ g/100g）/Bx以上的饮料。 

因化合物A是作为具有学习积极性改善作用的有用物质，所以优选饮料中的含量越高越好。具体地说，优选为1μg/100g以上，更优选为60μg/100g以上，进一步优选75μg/100g以上。 

优选化合物A的含量高，但因白利度高的饮料在香味、口感方面等不优选，所以，优选白利度越低越好。因此，优选大量含有作为有用物质的化合物A且白利度低的饮料，即化合物A的含量（μg/100g）和白利度（Bx）的比值高的饮料。具体地说，化合物A含量（μg/100g）和白利度（Bx）的比优选为0.1（μg/100g）/Bx以上，更优选为6以上，进一步优选为10以上。 

本发明的饮料具有如下特征，即具有学习积极性改善效果可长期持续摄取，同时还具有香味、口感好且外观也良好的特征。特别是使用上述本发明的提取物制造的饮料具有如下特征，无论是否高含量含有化合物A，但因添加到饮料中时不产生来自提取物的沉淀，所以在所得到的饮料中不含有来自提取物的沉淀。在此处，配合提取物的液体具有液体自身不含有沉淀的液体（例如使用透明果汁的饮料，代表性饮料有使用透明果汁的苹果汁等）和液体自身含有沉淀的液体（例如使用混浊果汁的饮料，代表性饮料有使用混浊果汁的橙汁等）。在不含有沉淀成分的液体中添加本发明的提取物而制备的饮料，在其所得到的饮料中也不含有沉淀。另一方面，在使用混浊果汁的饮料等其自身具有沉淀成分的饮料中添加本发明的提取物而制备的饮料虽含有来自混浊果汁的沉淀，但实质上不含有来自本发明提取物的沉淀。 

在不含有沉淀成分的液体中添加本发明的提取物而制备的饮料中，有无沉淀例如可通过如下操作确认，即通过目测或离心分离不能回收到固形成分。 

另一方面，在含橙汁的饮料等其自身具有沉淀成分的饮料中添加本发明的提取物而制备的饮料中，实质上不含有来自本发明提取物的沉淀，例如可如下确认，回收饮料中的沉淀，用十二烷基硫酸钠（以下称为“SDS”）等表面活性剂增溶的蛋白质量极少。如果含有来自提取物的成分的沉淀，则通过表面活性剂进行增溶处理会使来自提取物的蛋白质增溶，但实质上不含有来自提取物的沉淀时，则增溶量极少。另外，通过SDS进行的蛋白质的增溶可按照本领域技 术人员周知的方法进行，例如可通过使用SDS0.025%溶液进行。且增溶蛋白质的量极少是指用SDS0.025%溶液进行增溶处理，结果沉淀的固形物量（湿重量）中实质上不含有增溶蛋白质量（0.01mg/g沉淀以下，优选为0.001mg/g沉淀以下）。 

在此，沉淀的固形物量（湿重）是指将饮料用离心分离机在3000～5000rpm下进行1～5分钟离心处理后回收的湿润状态的固形成分的重量。 

本发明饮料的pH小于5。优选为pH4.5以下，进一步优选为4以下。 

本发明的饮料与通常的饮料同样，可制成容器装饮料。 

＜提取物或饮料的制造方法＞ 

本发明为含有化合物A的酸性提取物或饮料。这些酸性提取物或饮料例如可根据以下制造方法制备。 

（1）以鸟兽肉类、鱼肉类或贝肉类为原料，通过在液体中加热而除去这些原料中所含有的水溶性蛋白质的预处理工序； 

（2）在所述预处理后交换液体，再次加热的工序； 

（3）添加酸的工序；及 

（4）过滤所得到的液体样品的工序。 

在上述预处理工序（1）中使用的原料优选高效得到作为有用成分的化合物A的天然物，特别是鸟兽肉类、鱼肉类或贝肉类。在鸟兽肉类中，包含作为畜肉的牛、猪、马、羊及山羊、作为兽肉的畜肉以外的肉，例如野猪、鹿，作为家禽肉的鸡、火鸡、鹌鹑、鸭子及绍兴麻鸭(Anas platyrhyncha var.domestica）、作为野鸟肉的家禽肉以外的鸟类的肉，例如野鸭、雉、麻雀及斑鸫等。此外，还可使用通常饮食生活中所食用的鱼肉类及贝肉类。其他，作为植物体，也可使用咖啡、可可等。在这些鸟兽肉、鱼贝类及贝类中优选使用可高效、高浓度得到化合物A的鸡肉。 

使用鸡肉时可大量得到化合物A的理由还不明了，但推测因鸡肉的蛋白质大量具有连续的苯丙氨酸（-Phe-Phe-）的结构，大量生成二肽（Phe-Phe），因而作为结果可大量得到目的化合物A。 

作为预处理工序（1），只要进行减少原料中含有的水溶性蛋白质的处理即 可，例如只要在水中100℃～160℃下煮（boil）30分钟～数小时（优选为3小时～8小时左右，进一步优选为3小时～4小时左右）即可。作为加热装置，可根据条件使用压力锅、高压灭菌器等。此外，预处理工序（1）中，对交换液体的次数无限制。例如在工序（1）中，通过适当追加水等的液体、原料，可调节提取物或饮料的浓度。 

此外，加热工序（2）优选在高温高压（100℃以上、1大气压以上）下进行，例如优选为100℃以上，进一步优选为125℃以上。而且加热工序（2）的加热时间优选为30分钟～数小时，进一步优选为3～7小时左右。同样作为加热装置，可根据条件使用压力锅、高压灭菌器等。 

且也可不进行液体交换而连续进行预处理工序（1）及加热工序（2）的工序，也可在预处理工序后暂时取出肉，在进行液体交换之后再进一步进行加热工序。在预处理工序（1）之后进行液体交换，而后进行加热工序（2）的方法能得到白利度更低的样品，所以优选进行液体交换。 

另外，为了防止植物体及动物体会烤焦，工序（1）及工序（2）中的加热处理优选在溶剂中进行。作为溶剂，优选使用水、乙醇或这些的混合物等。即通过在含有蛋白质（优选大量具有连续的苯丙氨酸（-Phe-Phe-）结构的蛋白质）的植物体或动物体中混合溶剂进行加热处理，回收该溶剂，从而获得大量含有化合物A的溶液。 

为使在酸性状态下含有化合物A的液体（提取物）为不具有沉淀的状态、或添加提取物而制成的酸性饮料不具有沉淀的状态，必须对工序（2）中得到的化合物A含有物进行酸处理使其为酸性。该酸处理优选在工序（2）之后的工序中进行。作为所添加的酸无特别限定，优选食品制造中通常使用的食品添加剂、食品原料。作为食品添加剂，例如可列举己二酸、柠檬酸、乳酸、醋酸、葡萄糖酸内脂、富马酸、葡萄糖酸、冰醋酸、苹果酸、酒石酸、磷酸、L-抗坏血酸等。此外，作为食品原料，可列举衣康酸、植酸、α―酮戊二酸、咸梅汁、粮食醋、果汁、麦芽醋、葡萄醋、苹果醋、米醋等。只要是食品制造中通常使用的酸均可，优选香味优异的苹果酸、柠檬酸、磷酸。此外，酸可以使用1种或1种以上，无特别限定。 

酸的添加量为用于调节到所希望的pH而需要的量，可根据添加的酸的种类及所希望的pH适当确定。 

过滤工序中的过滤强度可根据添加提取物而获得的食品的形态适当选择，本领域技术人员也可适当确定该过滤方法。例如在固体食品（例如片剂）中使用时及不希望饮料澄清时，例如使用罐装饮料等看不见外观的容器时等，可为过滤预加热工序后的沉淀物的程度即可，也可利用过滤网进行过滤。此外，在希望为澄清时，例如用于透明瓶、PET瓶装饮料等中的情况下，需要进行强过滤。可通过用过滤网过滤后使用膜进行过滤（离子交换膜、RO膜、Zeta电位膜、UF膜）或使用珪藻土进行过滤等来进行澄清化。 

本发明提取物、饮料可直接使用大量含有该化合物A的溶液，也可根据需要进行浓缩以进一步提高化合物A浓度后使用。浓缩可通过蒸发器、冷冻干燥等进行。 

在浓缩前后，化合物A的含量虽有所增加，但化合物A的含量（单位：μg/100g）和白利度（Bx）的比几乎无变化。这是因为通过浓缩白利度（Bx）也增高了。因此，通过浓缩化合物A的含量（单位：μg/100g）和白利度（Bx）的比为6以上的溶液，可得到以更高含量含有化合物A、比为6以上的提取物，即使浓缩化合物A的含量（单位：μg/100g）和白利度（Bx）的比小于6的溶液可得到高含量含有化合物A的提取物，但也得不到化合物A的含量（单位：μg/100g）和白利度（Bx）的比为6以上的提取物。 

本发明的饮料可根据需要制成适当的容器装饮料。 

通过以下实施例更具体地说明本发明，但本发明不限于这些实施例。 

实施例 

＜实施例1＞化合物A的学习积极性改善作用（1） 

有关学习积极性增加作用，使用该技术领域已知的方法、即Morris水迷宫学习（Morris Water Maze：MWM）进行评价。 

首先，在直径90cm、高度35cm的圆筒状箱内，加入用墨汁染成黑色的水至水深20cm，水温为22±1℃。在该箱内放入C57BL/6小鼠（雄性、9周龄） 进行旷场游泳实验（OSS）。进行OSS时，小鼠的行动发生了变化即陷入相当于抑郁状态的状态。进行5天的OSS试验后，将小鼠分为7组。 

而后，在上述的直径90cm、高度35cm的圆筒状箱内，设置直径10cm的逃生平台并使水深为0.5cm。将化合物A（Bachem AG(Bubendorf,Switzerland)）或对比药物马来酸氟伏沙明（fluvoxamine maleate）对上述分为7组的小鼠口服给药。60分钟后，在设置有上述逃生平台的箱内放入小鼠，测定直到小鼠找到设置在水面下的不可视的逃生平台为止的时间（逃避潜伏期），评价空间认知的记忆学习力（MWM）。作为对照小鼠，将生理盐水对未进行OSS的动物给药，以进行MWM。MWM为1天5次，进行10天。 

结果如图1所示。图1表明，未进行OSS的小鼠（no OSS-Vehicle）逃避潜伏期因重复试验而缩短，但进行了OSS的小鼠的学习积极性降低，逃避潜伏期未缩短（OSS-Saline）。另一方面，在将化合物A给药的组中，随着给药量增加，逃避潜伏期缩短。在0.02mg/kg给药组中，与将生理盐水对未进行OSS的动物给药的对照组（OSS-Vehicle）相比，进行MWM试验10天后的逃避潜伏期缩短了20%左右。此外，在20mg/kg给药组中，与大量使用SSRI的马来酸氟伏沙明给药组（OSS-Fluvoxamine）相比，进行MWM试验10天后的到达时间基本为相同程度。由此表明，化合物A具有学习积极性增加作用。 

＜实施例2＞学习积极性改善作用（2） 

用与实施例1同样的方法，进一步追加0.002mg/kg给药组，同样进行MWM试验。 

进行MWM试验7天后的到达逃生平台的到达时间如图2所示。给药0.02mg/kg以上时可确认出化合物A的效果。由动物的有效量推算对人的给药量时，使用考虑到动物品种差别的系数10（食品的安全性评价、栗饭原景昭、内山充编著、学会出版中心（日语原名：食品の安全性評価、栗飯原景昭、内山充編著、学会出版センタ一）、1987），人给药量为小鼠给药量的1／10。因此，上述有效的0.02mg/kg在人（50kg）中为0.1mg／人。将含有化合物A的食品制成饮料，其容量为100ml时，其有效浓度为1.0μg/ml。 

＜实施例3＞学习积极性改善作用（3） 

用与实施例1同样的方法，将20mg/kg化合物A对小鼠给药后进行MWM试验。作为对比，在将直链状的二肽（Phe-Phe）20mg/kg给药后进行MWM试验。 

结果图3所示。图3表明，未能确认出直链状的二肽（Phe-Phe）具有显著的作用，但与对照组（OSS－Vehicle）相比，可看出化合物A的显著的学习积极性改善作用。即可知学习积极性改善作用需要有环状二肽结构。 

＜实施例4＞原料的探讨 

作为含有蛋白质的原料，使用牛肉、猪肉、鱼、鹌鹑肉、蚬贝、鸡肉（Black Chicken,Chicken）。在动物体中混合1倍量的水放入容器中，作为预处理工序，用高压灭菌器进行135℃4小时的预处理，作为加热工序，进行135℃4小时的加热处理。回收加热处理后的液体，添加食品添加剂75%磷酸（日本化学工业株式会社），调节pH到3。而后，用乙腈、用预处理色谱柱（OASIS MAX (Waters:30mg/1cc)）进行洗脱，通过高效液相色谱法（HPLC）对化合物A含量进行定量。HPLC的条件如下。结果如图4所示。 

（HPLC条件） 

·装置：Agilent 1100series 

·色谱柱：Develosil C30-UG-5(4.6x150mm,5μm) 

·流动相A：水、流动相B：100%乙腈溶液 

·注入量：10μl 

·UV检测器波长：215nm 

·流速：1.0ml/min 

·色谱柱温度：32℃ 

另外，虽可直接从烘焙咖啡豆中回收含有化合物A的液体，但在提取烘焙豆的咖啡饮料中未能测出化合物A。 

＜实施例5＞含有化合物A的酸性提取物的制造 

（1）作为除去水溶性蛋白质的预处理工序，将鸡肉（200g）及水（200g）加入装置色谱柱部，使用400cc高温高压反应器（株式会社AKIKO）进行高温高压处理。 

（2）而后，作为加热工序，仅将上述容器中的液体取出，废弃液体。加入与鸡肉的质量等量的水，再次与（1）同样进行高温高压处理。 

（3）将所得到的液体用40目左右的过滤网过滤。而后在滤液中添加食品添加用的酸（磷酸·柠檬酸·苹果酸等）以调节pH为3，离心分离（6500rpm、5分钟），进一步用过滤网（300目）过滤后，用5μm过滤器（住友3M公司制）过滤。 

另外,有关下述表1的提取物1,未进行预处理工序。 

对于各个提取物,测定pH、化合物A的含量及Bx，计算出化合物A含量/Bx的比。 

且对于Bx，使用Bx测定仪（RX-5000α：株式会社爱宕制）测定。 

由表1的结果可知，通过（1）进行除去预处理的水溶性蛋白质的工序，且将预处理条件设定为高温·长时间，可使（2）加热工序中得到的提取物的Bx变低。其结果表明，可得到化合物A的含量（μg/100g）和白利度（Bx）的比值高的提取物。 

表1 

＜实施例6＞通过添加酸性提取物确认有无沉淀 

将中性的鸡肉提取物、汤料（Consomme）及酸性提取物1g添加到用柠檬酸和柠檬酸三钠调节pH的各pH的液体100g中，观察此时有无沉淀。 

其结果，将市售的称为鸡肉提取物、汤料（Consomme）的中性物添加到酸性液体中时产生了沉淀。另外，汤料（Consomme）如包装上所记载，用水溶解使用（相对于汤料块（Consomme cube）3.55g，水为150ml）。 

另一方面，本发明的酸性提取物即使添加到酸性液体中也不产生沉淀，很稳定。 

另外，表中“○”表示添加到液体中的提取物等溶解后未产生沉淀，“×”表示添加到液体中的提取物等未溶解，产生了沉淀。 

表2 

＜实施例7＞沉淀的确认（1） 

（样品制作） 

有关下述混合液（a）（b），分别制作化合物A含量及白利度如表3所示的配方编号1～6的样品，有关混合液（c），制作化合物A含量及白利度如表3所示的配方编号1～9的样品。有关果汁（d），适当稀释调节，使其与如表3所示的配方编号1～9的白利度值一致。果汁（d）中不含有化合物A，化合物A含量/Bx的比均为0。 

如上所述分别制作的混合液（a）～（c）、果汁（d）的样品，用85℃10分钟杀菌。 

在此处使用的市售鸡肉提取物，白利度＝10，pH＝6.3，每100g提取物中化合物A含量为45μg。此外，市售鸡肉粉末是指将市售鸡肉提取物制成粉末后的粉末，每10g粉末中化合物A含量为45μg。本发明酸性提取物，白利度＝61.1，pH＝2.55，每1g酸性提取物中化合物A含量为48μg。苹果汁使用pH＝3.8的澄清果汁饮料。 

另外，因市售鸡肉提取物的化合物A含量/Bx比为4.5（μg/100g）/BX，所以，使用该提取物的混合液（a）无法制成化合物A含量/Bx比高于4.5（μg/100g）/Bx的样品。因此，仅制成了表3所示的配方编号1～6的样品。此外，使用将市售品鸡肉提取物制成粉末后的粉末的混合液（b）也同样，仅制成了 表3所示的配方编号1～6的样品。因此，混合液（a）（b）中未能探讨7，8，9的条件，仅探讨了1～6的条件。 

（a）市售鸡肉提取物和果汁100%苹果汁的混合液 

（b）市售提取物粉末和果汁100%苹果汁的混合液 

（c）本发明酸性提取物和果汁100%苹果汁的混合液 

（d）果汁100%苹果汁（对照） 

（沉淀产生及口感的确认） 

将经过上述杀菌的样品静置，用目测确认有无沉淀产生及确认口感。结果如表4的“沉淀”“口感”所示。 

在此，“×”表示无法目测到沉淀，“○”表示能目测到沉淀。 

此外，口感评价用与对照（将市售苹果汁用水稀释后调节到与配方编号1～9相同的Bx）相对比的5级评价， 

5···与对照同样润滑 

4···与对照相比有微妙的粗糙感 

3···与对照相比稍有粗糙感 

2···与对照相比有粗糙感 

1···与对照相比有明显的粗糙感 

（固形成分及蛋白质浓度的测定） 

1.将制作的各样品20g离心（4000rpm、1分钟）后除去液体部，回收产生的沉淀即固形成分，测定重量。 

2.取1.的固形成分0.05g，添加0.025%SDS（Sigma Catalogue#L3771）200μl。 

3.将2.中制备的样品用漩涡混匀器（vortex）搅拌后离心（14,000rpm、1分钟）。 

4.取3.的上清20μl，与室温下的考马斯亮蓝（Bradford）试剂（BIO-RADCatalog#500-0205)1ml混合。 

5.使4.的溶液在室温下反应5分钟以上后，使用分光光度计（UV-1601UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETER SHIMADZU)测定595nm处的吸光度。 

6.通过预先制作的校正曲线，由5.中得到的吸光度求出蛋白质浓度。 

7.以6.中得到的蛋白质浓度为基础，求出沉淀1g中的蛋白质量。 

表4表示1.中求出的固形成分“固体量g”、6.中求出的蛋白质浓度“沉淀中的蛋白质量（mg）”、7.中求出的“蛋白质量(mg)/g沉淀”。 

另外，在此处使用的校正曲线根据以下顺序制作。 

1.将牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）2mg/ml(BIO-RAD)（Catalog #500-0206)70μl与0.025%SDS70μl混合，得到1000g/ml的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）溶液。 

2.将1.中得到的溶液用0.025%SDS70μl进行分级稀释，制成750g/ml、500g/ml、250μg/ml、125μg/ml的牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）。 

3.0μg/ml的溶液使用0.025%SDS70μl。 

4.将上述牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）溶液分别各取20μl，与室温下的考马斯亮蓝（Bradford）试剂（BIO-RAD Catalog#500-0205)1ml混合。 

5.与考马斯亮蓝（Bradford）试剂在室温下反应5分钟以上后，使用分光光度计（UV-1601UV-VISIBLE SPECTROPHOTOMETER SHIMADZU)测定595nm处的吸光度。 

6.由求出的吸光度和牛血清白蛋白（Bovine Serum Albumin）溶液浓度制作校正曲线。 

表3 

  配方编号   1   2   3   4   5   6   7   8   9   化合物A   30ug   60ug   100ug   30ug   60ug   100ug   30ug   60ug   100ug   化合物A/Bx   1   1   1   4.5   4.5   4.5   6   6   6   Bx   6   12   20   1.33   2.66   4.44   1   2   3.33   重量   500g   500g   500g   500g   500g   500g   500g   500g   500g

 表4 

＜实施例8＞沉淀的确认（2） 

有关下述混合液（f）（g）,与实施例7同样，分别制备化合物A含量及白利度如表3所示的配方编号1～6的样品，有关混合液（h），制备化合物A含量及白利度如表3所示的配方编号1～9的样品。有关果汁（i），适当稀释调节，使其与如表3所示的配方编号1～9的白利度值一致。果汁（i）中不含有化合物A，化合物A含量/Bx的比均为0。 

如上所述分别制作的混合液（f）～（h）、果汁（i）的样品用85℃10分钟杀菌。 

在此处使用的市售鸡肉提取物，白利度＝10，pH＝6.3，每100g提取物中化合物A含量为45μg。此外，市售鸡肉粉末是指将市售鸡肉提取物制成粉末后的粉末，每10g粉末中化合物A含量为45μg。本发明酸性提取物，白利度＝61.1，pH＝2.55，每1g酸性提取物中化合物A含量为48μg。橙汁使用pH＝3.74的混浊果汁饮料。 

另外，因市售鸡肉提取物中化合物A含量/Bx比为4.5（μg/100g）/BX， 所以，使用该提取物的混合液（f）无法制成化合物A含量/Bx比高于4.5（μg/100g）/Bx的样品。因此，仅制成了表3所示的配方编号1～6的样品。此外，使用将市售品鸡肉提取物制成粉末后的粉末的混合液（b）也同样，仅制成了表3所示的配方编号1～6的样品。因此，混合液（f）（g）中未能探讨7，8，9的条件，仅探讨1～6的条件。 

（f）市售鸡肉提取物和果汁100%橙汁的混合液 

（g）市售提取物粉末和果汁100%橙汁的混合液 

（h）本发明酸性提取物和果汁100%橙汁的混合液 

（i）果汁100%橙汁（对照） 

将所制作的各样品用与实施例7同样的方法确认有无沉淀，评价口感，测定固形成分及蛋白质浓度。结果如表5所示。 

表5 

＜实施例9＞含有化合物A的酸性饮料的制造（1） 

将提取物添加到饮料中。配方如下。 

酸性提取物为将实施例5-提取物3（如表1所示）用蒸发器浓缩而制成。 

表6 

  酸性提取物  浓缩实施例5-提取物3   Bx   61.1   酸度(g/100g)   36.36   pH   2.55   化合物A(ug/100g)   4806   比值   78.7

表7 

＜实施例10＞含有化合物A的提取物粉末的制造 

将上述实施例5中制造的提取物冷冻干燥，制造提取物粉末。 

1.取酸性提取物（实施例5的提取物3（如表1所示））100g在200ml茄型烧瓶中。 

2.用冰箱（-18℃）保管2-3天直至完全冷冻。 

3.设置冷冻干燥机（LABCONCO制、设定在-40℃以下），持续进行冷冻干燥直至完全干燥。 

如上所述得到干燥粉末2g。 

本发明提供具有学习积极性改善作用、无副作用且安全性高的酸性提取物及饮料。本发明的酸性提取物不产生沉淀且不损坏饮食物原本的呈味，可添加到酸性饮料等中。本发明的酸性提取物或饮料、进而添加这些提取物或饮料的饮食品可作为对改善学习积极性有用的饮食品而长期持续摄取。 

本文标签： 苯基提取物酸性甲基饮料