一种卷丹百合愈伤组织的诱导方法

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本发明公开了一种卷丹百合愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：将预处理并灭菌后的卷丹百合珠芽或鳞片接种于诱导培养基中，光照强度为700 lx‑900 lx，培养20‑30天，即得到卷丹百合的愈伤组织，所述诱导培养基为MS+1.00 mg/L 6‑BA+0.15 mg/L NAA+0.20 mg/L KT+0.05~0.1 mg/L 2,4‑D，培养基pH值为5.8~6.2。通过6‑BA、NAA、KT和2,4‑D成分含量及一定的光照之间的协同配伍作用，共同调节植物内源激素水平，从而诱导卷丹百合产生愈伤组织，诱导率达到71%。采用本发明方法仅20天可以有效诱导卷丹百合的愈伤组织形成，克服了其愈伤组织难于诱导的问题，为卷丹百合的无性繁殖、抗病育种以及分子生物学研究等奠定基础。

1.一种卷丹百合愈伤组织的诱导方法，其特征在于，包括以下步骤：将预处理并灭菌后的卷丹百合鳞片或珠芽接种于诱导培养基中进行初代培养，光照强度为700lx-900lx，诱导培养20-30天，即得到卷丹百合的愈伤组织和无菌不定芽；所述诱导培养基为MS+1.00mg/L6-BA+0.15mg/LNAA+0.20mg/LKT+0.05~0.1mg/L2-4,D，培养基pH值为5.8~6.2。 2.根据权利要求1所述卷丹百合愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述鳞片为鳞茎的中层或外层鳞片。 3.根据权利要求1所述卷丹百合愈伤组织的诱导方法，其特征在于，还包括将所述无菌不定芽的基部膨大部分转接于所述诱导培养基中继续培养，光照强度为700lx-900lx，诱导培养20-30天，即得到卷丹百合的愈伤组织。 4.根据权利要求1所述卷丹百合愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养基为MS+1.00mg/L6-BA+0.15mg/LNAA+0.20mg/LKT+0.05mg/L2-4,D，培养基pH值为5.8~6.2。 5.根据权利要求1或3所述卷丹百合愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述诱导培养的条件为培养温度为25±2℃，湿度为60％~70％，光照时间为12~14h/d。 6.根据权利要求1所述卷丹百合愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述预处理为将百合珠芽或鳞片用清洁剂溶液浸泡5-10min，再用流动的自来水冲洗2h以上；所述灭菌为将预处理后的卷丹百合珠芽或鳞片置于超净工作台上，先用体积浓度为70~75%的乙醇水溶液处理20~30s，然后用无菌水清洗至少2次，再用质量浓度为0.1~0.2%的升汞溶液灭菌处理10~25min，最后用无菌水洗涤至少4次。 7.根据权利要求6所述卷丹百合愈伤组织的诱导方法，其特征在于，所述清洁剂为肥皂、洗衣粉或无患子皂素。

技术领域

本发明属于百合组织培养技术领域，具体涉及一种卷丹百合愈伤组织的诱导方法。

背景技术

卷丹百合(Lilium lancifolium Thunb.)为百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)最为古老的栽培种，虽然起源地不详，但分布极广。野生卷丹百合多分布在亚洲东部、日本及朝鲜。在我国分布极广，从西南的云贵高原到东北的长白山区都有它的踪迹，主要分布区为西藏、青海、甘肃、陕西、江苏、浙江、安徽、河北、山东和吉林等地。卷丹百合是一种集药用、食用和观赏为一体的优良植物。卷丹百合药用价值体现在清肺止咳、清心安神等功效，在长江中下游卷丹百合广为栽培，是百合药材的主要来源。卷丹百合(宜兴百合)同兰州百合、龙牙百合(百合)称为中国三大食用百合品种，卷丹百合中8种人体必须氨基酸含量比兰州百合高7.05％，总氨基酸含量比兰州百合高出11.24％；矿质元素中，除磷、钾外，卷丹百合中钙、铁、铜、锰、锌、镁、硒含量均高于兰州百合；基本营养成分中，除淀粉、果胶、还原糖外，卷丹百合中蛋白、脂肪、粗纤维、Vc、总磷脂含量均高于兰州百合。因此，卷丹百合在低脂肪，高营养与良好保健功能的潜在价值值得开发。卷丹百合花大、颜色丰富，耐低温和干旱，其珠芽播种繁殖方便等优良性状，在园林中可以作地被可直接应用于城市园林绿化、家庭院落及盆栽等，是园林普遍应用的球根花卉之一。因此，卷丹百合具有良好的市场价值。

卷丹百合抗病性较差，其中常见病害如灰霉病(Botrytis elliptica)、叶尖干枯病(Phoma lilii)和炭疽病(Colletotrichum lilii)等，常见的病毒有黄瓜花叶病毒(CMV)、百合无症病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)等20多种病毒。病害会导致卷丹百合的植株枯萎，观赏性下降，而且种球品质受到影响，药用价值大大降低。改善以上问题可以通过育种的方法来解决。常见的植物抗病育种手段有系统选育、远缘杂交和生物技术育种等，结合生物技术的抗病体外选择和体细胞无性系变异是近年研究者开始尝试的有效手段，并取得进展。体细胞无性系变异进行抗病育种的方法是不经体外选择，直接对经组织培养再生的植株或移栽苗进行抗病检测，其与在大田中筛选抗病植株相比大大缩短育种年限。其中，脱分化和再分化很容易产生变异，因而体细胞无性系变异常采用愈伤组织培养，愈伤组织(Callus)是指植物在受到创伤后进行自我修复在有伤口的地方所生长出新的细胞或者组织。从外植体到形成愈伤组织要经历启动期、分裂期和成熟期三个时期。不同植物愈伤组织诱导的能力和形成部位不同；同一植物不同部位诱导愈伤的能力也是不同的。有关卷丹百合组织培养方面的研究已有一些报道，如郭海滨和雷家军(2006)、马素娴等(2012)以及杨利平和宋晓宏(2013)等；但是所有研究表明，卷丹百合的愈伤组织诱导效率极低，尤其难于诱导产生大量愈伤组织(块)。另外，利用现有野百合、兰州百合等常见品种的诱导培养基并不适用于卷丹百合，其原因可能是卷丹百合为三倍体品种，无法有效诱导其外植体上产生愈伤组织，多数只能产生不定芽。因此，对卷丹百合愈伤组织的定向培养非常必要，具有重要科学意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种卷丹百合愈伤组织的诱导方法，主要解决卷丹百合外植体愈伤组织难以诱导和污染率高的问题。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种卷丹百合愈伤组织的诱导方法，包括以下步骤：

将预处理并灭菌后的卷丹百合鳞片或珠芽接种于诱导培养基中进行初代培养，光照强度为700lx-900lx，诱导培养20-30天，即得到卷丹百合的愈伤组织和无菌不定芽；所述诱导培养基为MS+1.00mg/L 6-BA+0.15mg/L NAA+0.20mg/L KT+0.05～0.1mg/L 2-4,D，培养基pH值为5.8～6.2。

优选的，所述鳞片为鳞茎的中层或外层鳞片。

优选的，还可以将所述无菌不定芽基部膨大部分(下称无菌小鳞茎)转接于所述诱导培养基中继续培养，光照强度为700lx-900lx，诱导培养20-30天，即得到卷丹百合的愈伤组织。

优选的，所述诱导培养的条件为在培养温度为25±2℃，湿度为60％～70％，光照时间为12～14h/d。

优选的，所述预处理为将百合珠芽或鳞片用清洁剂溶液浸泡5-10min，再用流动的自来水冲洗2h以上；所述灭菌为将预处理后的卷丹百合珠芽或鳞片置于超净工作台上，先用体积浓度为70～75％的乙醇水溶液处理20～30s，然后用无菌水清洗至少2次，再用质量浓度为0.1～0.2％的升汞溶液灭菌处理10～25min，最后用无菌水洗涤至少4次。

优选的，所述清洁剂为肥皂、洗衣粉或无患子皂素。

相比现有技术，本发明具有如下有益效果：

1、本发明采用MS培养基作为基本培养基，并辅以外源植物激素、生长调节类物质，为卷丹百合愈伤组织产生提供能量，能够促进加速卷丹百合愈伤组织的生长，从而满足卷丹百合在营养上和生理上对细胞脱分化的要求，特别是通过6-BA、NAA、KT和2,4-D成分含量及一定的弱光之间的协同配伍作用，共同调节卷丹百合的内源激素水平，从而诱导卷丹百合自身产生愈伤组织，20天就可以获得大量的愈伤组织，诱导率达71％，解决了卷丹百合组织培养过程中难以产生愈伤组织的技术问题，本发明为卷丹百合的无性繁殖、抗病育种以及分子生物学研究奠定基础。

2、本发明采用的外植体为珠芽、鳞茎的中外层鳞片或初代培养后产生的无菌小鳞茎，具有材料易得、操作简便、繁殖快速的特点，其中经初代培养的无菌小鳞茎诱导培养过程中污染率远低于其它外植体，仅为2.5％，且愈伤组织诱导率达35％，解决了卷丹百合组织培养过程中污染率高和难以产生愈伤组织的技术问题。

附图说明

图1为诱导卷丹百合珠芽的形态变化；

图A为2-3天的珠芽鳞片，B为10天后的珠芽鳞片，C为2周后的珠芽鳞片，D为20-30天珠芽鳞片产生的愈伤组织，E为30天后珠芽鳞片产生的愈伤组织开始死亡；

图2为在不同光照条件下诱导无菌小鳞茎产生的愈伤组织；

图A是光照强度为0-300lx条件下诱导形成的愈伤组织；B是在光照强度为700-900lx条件下诱导形成的愈伤组织；C是在光照条件为1500-2000lx条件下诱导形成的愈伤组织。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步详细说明。

1、仪器设备：

蒸汽压力灭菌锅、干热消毒柜、过滤灭菌装置、喷雾消毒器、紫外灯、电子天平、超净工作台、冰箱、天平、电磁炉、培养瓶、不锈钢接种盘、手术接种剪、直镊、枪型接种镊、手术刀柄等。

2、试剂配制：

(1)75％的酒精：75ml的95％的酒精加水定容至95ml。

(2)0.1％(0.2％)的升汞溶液：称取1克(2克)HgCl2，加蒸馏水至1000ml。

(3)1mol/LHCL溶液：取8.25ml的浓盐酸，加蒸馏水定容至100ml。

(4)1mol/LNaOH溶液：称8gNaOH，用蒸馏水定容至200ml。

3、培养基配制：

组织培养的基本培养基(MS)：

每升培养基含NH4NO3 1650mg，KNO3 1900mg，CaCl2·2H2O 440mg，MgSO4·7H2O 370mg，KH2PO4 170mg，KI 0.83mg，H2BO3 6.2mg，MnSO4·4H20 22.3mg，ZnSO4·7H2O 8.6mg，Na2MoO4·5H2O 0.25mg，CuSO4·5H2O 0.025mg，CoCl2·6H2O 0.025mg，FeSO4·7H2O 27.8mg，Na2-EDTA·2H2O 37.3mg，肌醇100mg，烟酸0.5mg，甘氨酸2mg，盐酸吡哆醇(维生素B6)0.5mg，盐酸硫胺素(维生素B1)0.4mg和30g蔗糖。

pH调节：滴加1mol的HC1或NaOH水溶液调节培养基pH值至5.8-6.2。

配置好的培养基分装至培养瓶，然后将分装好的培养基用蒸汽压力灭菌锅在121℃高温下灭菌后，放在无菌环境中存放待用。

4、植物生长激素：

生长素类：萘乙酸(1-Naphthylacetic acid，NAA)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-Dichlorophenoxyacetic acid，2,4-D)；

细胞分裂素类：6-苄氨基腺嘌呤(6-Benzylaminopurine，6-BA)、6-糖基氨基嘌呤(6-Furfurylaminopurine，KT)。

5、对愈伤组织进行观察统计：

每隔2-3天对材料进行观察，看其生长发育情况，如材料的颜色、大小等的变化，并在20天时统计材料的污染率、出芽率、愈伤诱导率。

实施例1

1)卷丹百合珠芽的预处理

在自来水下清洗卷丹百合珠芽表面的污垢，挑出表面有机械损伤、病虫害的珠芽，将健康的珠芽，用清肥皂水浸泡7-8min，再用流动的自来水冲洗2h以上。

2)卷丹百合珠芽的灭菌

在无菌操作台上用解剖针将珠芽拨开分成若干大小均一的珠芽鳞片，先用75％乙醇将清洗消毒30s，用高温灭菌水清洗2-3次倒掉后再加入0.20％升汞溶液(升汞溶液要淹没珠芽鳞片)，盖上容器盖子放在摇床上摇晃10-15min，让升汞溶液与珠芽鳞片充分接触使消毒更彻底，然后又在无菌操作台上将升汞溶液倒掉，加入高温灭菌水并清洗4-6次。

3)卷丹百合珠芽的诱导

将经预处理和灭菌后的珠芽鳞片，分别接种于含有不同浓度2,4-D(0.01、0.05、0.1、0.5mg/L)的诱导培养基中，每瓶培养基上各放5颗珠芽鳞片，每个浓度梯度各放10瓶培养基。诱导培养的条件为在培养温度为25±2℃，培养20天，湿度为60％～70％，光照条件为1500lx-2000lx，12～14h/d。

诱导培养基成分：MS+6-BA 1.00mg/L+NAA 0.15mg/L+KT 0.20mg/L+2-4,D(0.01、0.05、0.1或0.5mg/L)。

每隔2-3天对材料进行观察，看其的生长发育情况，如材料的颜色、大小等的变化。如图1所示，在接种2-3天后，珠芽鳞片的外表变褐色(图A)。1周过后珠芽鳞片有膨大情况出现，10天后珠芽鳞片周围渐渐可以看到凸起的细胞团或芽点出现(图B)，2周后可以明显的看到愈伤组织和不定芽的出现(图C)，20-30天是愈伤组织出现最多(图D)，但30天后愈伤组织开始慢慢死亡，不定芽的量则开始增多，根也开始出现，说明愈伤组织开始分化(图E)。

在20天时统计材料的污染率、出芽率、愈伤诱导率。如表1所示。

表1诱导卷丹百合珠芽鳞片(初代培养)愈伤培养情况

实施例2

1)卷丹百合鳞片的预处理

在自来水下清洗掉卷丹百合种球表面的土壤和杂质，剥去鳞茎外围受病虫害侵害或有其他损伤的鳞片，取中层无机械损伤、无病虫害、健康的鳞片，用一定浓度的无患子皂素溶液浸泡5min，再用流动的自来水冲洗2h以上备用。

2)卷丹百合鳞片的灭菌

在无菌操作台上先用70％乙醇将清洗干净的鳞片初消毒30s，后用高温灭菌水清洗2-3次，再加入0.10％升汞溶液浸泡盖好容器盖子放在摇床上摇晃20-24min，使鳞片与升汞溶液充分接触，取出后在无菌操作台上将升汞溶液中倒掉，用高温灭菌水清洗4-6次。

3)卷丹百合鳞片的诱导

将经预处理和灭菌后鳞片横切成1cm2左右的小块，分别接种于含有不同浓度2,4-D(0.01、0.05、0.1、0.5mg/L)的诱导培养基上，每瓶培养基上各放5块鳞片，每个浓度培养基各放10瓶培养基。诱导培养的条件为在培养温度为25±2℃，培养20天，湿度为60％～70％，光照条件为1500lx-2000lx，12～14h/d。

诱导培养基成分：MS+6-BA 1.00mg/L+NAA 0.15mg/L+KT 0.20mg/L+2-4,D(0.01、0.05、0.1或0.5mg/L)。

在20天时统计材料的污染率、出芽率、愈伤诱导率。如表2所示。

表2诱导卷丹百合鳞片(初代培养)愈伤培养情况

实施例3

1)卷丹百合鳞茎盘的预处理

在自来水下清洗掉卷丹种球表面的土壤和杂质后用小刀将鳞茎盘从鳞茎基部切取，取无病虫害的、机械损伤的、健康的基盘，用肥皂水溶液浸泡10min，后用清水清洗后在洁净的流动水下水下让清洗3h以上。

2)卷丹百合鳞茎盘的灭菌

在无菌操作台上先用75％乙醇将清洗干净的鳞茎盘消毒1min，用高温灭菌水洗2-3次，再用0.20％升汞溶液浸泡鳞茎盘10-15min，期间放在摇床上让其不停晃动，其目的在于让鳞茎基盘充分的被升汞溶液侵泡使消毒更彻底，最后将消毒液倒掉后加入高温灭菌水清洗4-6次。

3)卷丹百合鳞茎盘的诱导

将经预处理和灭菌后的鳞茎盘横切成1cm2左右的小块，分别接种于含有不同浓度2,4-D(0.01、0.05、0.1、0.5mg/L)的诱导培养基中，每瓶培养基上各放5块鳞茎基盘，每个浓度梯度放10瓶培养基。诱导培养的条件为在培养温度为25±2℃，培养20天，湿度为60％～70％，光照条件为1500lx-2000lx，12～14h/d。

诱导培养基成分：MS+6-BA 1.00mg/L+NAA 0.15mg/L+KT 0.20mg/L+2-4,D(0.01、0.05、0.1或0.5mg/L)。

在20天时统计材料的污染率、出芽率、愈伤诱导率。如表3所示。

表3诱导卷丹鳞茎盘愈伤培养情况

实施例4

随机选取实施例1或2中在每组相同2,4-D浓度的诱导培养基中培养20天后产生的无菌小鳞茎200个，分别接种于对应相同浓度2,4-D的诱导培养基上，诱导培养条件：培养温度为25±2℃，湿度为60％～70％，光照条件为1500lx-2000lx，12～14h/d诱导培养20-30天。

在20天时统计材料的污染率、出芽率、愈伤诱导率。如表4所示。

表4诱导卷丹无菌小鳞茎愈伤培养情况

从表1-4可以看出，外植体为卷丹鳞茎盘时污染率最高，污染率达到了80％以上。外植体为无菌小鳞茎时，污染率远低于其它外植体，仅为2.5％，且愈伤组织诱导率与外植体为珠芽或鳞片时相差不大，可有效解决诱导愈伤组织污染率高的问题。当诱导培养基中2,4-D浓度为0.1mg/L时出芽率最高，珠芽可以达到86％，无菌小鳞茎可以达到87.5％。当诱导培养基中2,4-D浓度为0.05mg/L时愈伤率最高，珠芽可以达到38％，但其污染率14％；无菌小鳞茎可以达到35％，其污染率仅为5％。因此，诱导培养基为MS+6-BA 1.00mg/L+NAA 0.15mg/L+KT 0.20mg/L+2-4,D 0.05mg/L时有利于卷丹百合愈伤组织的诱导，与现有愈伤组织百合诱导培养基中植物激素差异较大，其原因可能为不同品种百合的内源激素水平不同，因此在离体培养中所需要的外源生长调节剂也不相同。因为外源激素主要通过影响植物内源激素发挥作用，外源激素的作用效果与外植体以及愈伤组织本身内源激素的种类和水平有密切关系。另外，将无菌不定芽转接到新鲜的诱导培养基中进行继续培养后，可限制其分化出不定芽，而诱导形成愈伤组织(块)。

实施例5

实验步骤同实施例4，其中光照强度分别为0-300lx、700-900lx和1500-2000lx，光照时间为12～14h/d，诱导培养基为MS+6-BA 1.00mg/L+NAA 0.15mg/L+KT 0.20mg/L+2-4,D 0.05mg/L。

将无菌小鳞茎转接到新鲜的诱导培养基中进行继续培养，在20天时对材料进行观察，转接到新的培养基后，可诱导形成愈伤组织，并限制其分化出不定芽。如图2所示，在光照条件为0-300lx条件下形成的愈伤组织大小不均等，近白色透明状(图A)。在光照条件为700-900lx条件下，易形成愈伤组织块，产生的愈伤组织色素含量低，为透明状(图B)；而在光照条件为1500-2000lx条件下形成的愈伤组织色素含量较高，不透明(图C)。

在20天时统计材料的污染率、出芽率、愈伤诱导率。如表5所示。

表5不同光照强度下卷丹百合愈伤组织的情况

如表5可以看出，当光照强度为700lx-900lx时，愈伤率为最高，20天无菌小鳞茎愈伤诱导率达到71％，解决了现有诱导培养基诱导卷丹百合产生愈伤组织效率极低的问题。较黑暗条件愈伤率提高了2.38倍，较强光条件愈伤率提高了1.22倍，这与普遍认为黑暗对百合愈伤组织有促进作用不相符。这是由于一定的光照可以调节卷丹百合体内的某些内源激素水平，从而诱导产生愈伤组织，而不同品种百合的内源激素水平不同，所以对光照强度的需求不同。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

本文标签： 诱导百合组织方法