一种作为断乳仔猪饲料添加剂的表达乳铁蛋白重组乳酸菌组合物

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本发明涉及一种作为断乳仔猪饲料添加剂的表达乳铁蛋白重组乳酸菌组合物，其特征在于，所述组合物将戊糖乳杆菌（Lactobacillus?pentosus?KLDS1.0413）和植物乳杆菌（Lactobacillus?plantarum?KLDS1.0344）作为口服活载体，其中，戊糖乳杆菌和植物乳杆菌中均含有连接有PLF基因的穿梭表达载体pPG612.1。本发明可以替代抗生素，乳铁蛋白还能刺激肠道细胞的生长，增加肠道中有益菌群，如双歧杆菌和乳酸杆菌等的数量，减少大肠杆菌等有害菌群的繁殖，从而保障仔猪肠道健康发育，增强仔猪肠道对营养物质的消化、吸收能力，降低腹泻率，提高其生长性能，促进仔猪生长。

1.一种作为断乳仔猪饲料添加剂的表达乳铁蛋白重组乳酸菌组合物，其特征在于，所述组合物将戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)KLDS1.0413和植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)KLDS1.0344作为口服活载体，其中，戊糖乳杆菌和植物乳杆菌中均含有连接有PLF基因的穿梭表达载体pPG612.1，所述PLF基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。 2.权利要求1所述的表达乳铁蛋白重组乳酸菌组合物在断乳仔猪饲料添加剂方面的用途。

技术领域

本发明涉及一种作为断乳仔猪饲料添加剂的表达乳铁蛋白重组乳酸菌组合物， 可作为活菌制剂直接添加到仔猪日粮中，进而提高仔猪生长性能，免疫功能和肠道 微生态健康，属于基因工程和饲料科学领域。

背景技术

断奶时期在猪的整个生长周期中是一个非常具有挑战性且影响重大的时期，断 乳仔猪饲养中由于环境和营养条件的变化，使仔猪的肠道内正常菌群遭受破坏，加 上断奶后胃肠消化酶减少，活性不足，影响对饲料的消化，引起消化不良性腹泻； 仔猪由于免疫系统发育不完善，对抗原刺激反应很弱，不能积极地产生主动免疫， 只能从母乳中获得被动免疫，断乳后，会造成免疫机能下降，另外仔猪的神经调节 机能弱，在断奶、更换饲料、变换环境等应激状态下会诱发一系列的断乳应激综合 症，甚至造成死亡。改善饲料品质是减少断乳应激的主要防治措施。日粮品质的改 善主要体现在基本营养成份的改善和添加剂的使用两方面：

饲料基本营养成分的改变主要考虑日粮中蛋白质的消化率、适口性、氨基酸平 衡和是否有免疫保护等，以及应用一些优质原料，提高断乳仔猪日粮的可消化性， 降低其抗原性。为提高早期断乳仔猪的采食量，弥补消化酶和胃酸的不足，目前国 内外在早期断乳日粮中普遍使用的添加剂主要有酸化剂、调味剂、酶制剂等。近年 来提出的益生素的研究引起越来越多人的关注，其作为一种活菌制剂通过在肠道内 的大量繁殖来调节肠道菌群的平衡，并在代谢过程中产生有机酸、酶、氨基酸及一 些生长因子来增强动物的抗病力。

乳铁蛋白(Lactoferrin，LF)是一种天然活性铁结合糖蛋白，广泛存在于动物的 乳汁(初乳)、血液、唾液、小肠液等外分泌液或血浆、中性粒细胞中。其中除乳腺 组织中含量丰富外，其他组织中均含量甚微。LF能够调节机体对铁的需求，影响 肠黏膜对铁的吸收，从而达到机体内铁离子的平衡。动物机体内转运铁离子的蛋白 有运铁蛋白和乳铁蛋白，都具有运输铁的功能，由于运铁蛋白在极酸性的胃环境内 不能正常发挥其运送铁的能力，而乳铁蛋白能够抵抗胃酸，仍然能保持自身生理功 能，因此乳铁蛋白才能在动物肠道内运送铁离子。当LF运送到达肠道后，与肠黏 膜细胞表面的特异性受体细胞结合，再由这些受体细胞运送铁离子进入细胞内部， 然后乳铁蛋白-R进入细胞内部，释放铁离子，从而达到增强机体对铁的吸收作用， 它能使吸收率提高5～7倍。另外，现已经确定LF广谱的抗菌和抗病毒活性，对 革兰氏阴性菌和阳性菌均有抑制作用，针对需铁的革兰氏阴性菌，如大肠菌群、沙 门氏菌等；可抑制的革兰氏阳性菌有金黄色葡萄球菌、单细胞李斯特菌等，但基本 不抑制对铁需求不高的细菌,如乳酸菌。在抗病毒方面，对牛LF研究成果较显著， 研究比较多的如单纯疱疹病毒、丙肝病毒、人免疫缺陷性病毒、人巨细胞病毒、人 乳头瘤病毒及猫科动物免疫缺陷性病毒都有很强的抑制作用。LF还是一种天然的 机体免疫调节剂。LF能够发挥其特异的调节功能，主要是与其靶细胞表面的特异 性受体结合的能力，机体释放出的LF能够与致病菌细胞膜表面的受体结合，并导 致病菌的死亡，从而发挥免疫调节的功能，同时还能够调节机体细胞因子的水平， 促进抗体的生成，诱导机体体液免疫应答，促进B细胞和T细胞的成熟和淋巴细 胞增生，从而减轻炎症反应。LF还有促进中性白细胞向受伤部位的吸附和聚集、 增加粒细胞黏性、调节免疫球蛋白分泌、参与调节机体免疫耐受能力、促进细胞间 相互作用、抑制补体系统激活或激活已有的补体途径等功能。断乳后乳铁蛋白的补 充可提高早期断奶仔猪生产性能、促进肠黏膜发育、改善肠道微生物菌群、增强肠 道黏膜分泌型免疫球蛋白A和肠道细胞因子的产生，但由于乳铁蛋白来源有限， 大肠杆菌及酵母菌的体外表达，纯化成本高，难以在生产中推广应用；如果以益生 性乳酸菌进行分泌表达，通过发酵罐大量培养后以活菌制剂的形式，无需纯化，可 直接作为饲料添加剂饲喂仔猪，既可以抑制断乳应激的产生，又可以替代抗生素在 饲料生产中进行应用，为健康环保的绿色添加剂。

乳酸菌（Lactic Acid Bacteria,LAB）是一群可以发酵碳水化合物（主要指葡萄 糖）产生乳酸的革兰氏阳性兼性厌氧细菌，广泛存在于人、畜的消化道中并发挥着 重要的生理功能。主要包括乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、肠球菌、链球菌等十 几个属。乳杆菌(Lactobacillus)是乳酸菌属中最重要的一个种属，乳酸乳球菌长期 以来在食品工业应用广泛，被公认为安全级（GRAS，generally recognized as safe） 微生物。以乳酸乳球菌作为宿主菌，构建表达载体用来表达异源蛋白和酶，已经成 为食品工业、疫苗开发及生物制药研究的热点，尤其在食品工业领域更是深入，以 其营养价值高、生长迅速、操作简单等优点成为表达外源蛋白、作为活载体疫苗的 理想选择。

现有技术中，以牛初乳为原料，利用色谱法、超滤法、盐析法以及酸沉淀法等 从乳液中分离纯化乳铁蛋白。通过以上工艺制备的乳铁蛋白作为饲料添加剂直接添 加到动物日粮中以发挥其生物学功能。其缺点是原料来源有限，工艺繁琐，耗资高， 只能小规模的进行实验研究，不能在生产中应用推广。此外，通过基因工程生产乳 铁蛋白作为饲料添加剂，已经有报导成功在大肠杆菌和毕赤酵母中表达乳铁蛋白， 通过基因工程的方法，得到完整的cDNA,构建生产乳铁蛋白原核表达载体，通过 发酵法大量生产乳铁蛋白。经过分离纯化，获得重组乳铁蛋白，作为饲料添加剂直 接添加到动物日粮中以发挥其生物学功能。而这一方法的缺点是酵母菌和大肠杆菌 都不能大量直接添加到饲料中饲喂动物，所以所表达的乳铁蛋白也需要纯化，纯化 成本高，难以在生产中推广应用。

发明内容

本发明依据乳铁蛋白的多种生物活性，合成了猪（porcine）乳铁蛋白（PLF） 基因，其核苷酸序列为SEQ No.1，选择公认的安全级（GRAS,generally recognized  as safe）乳酸杆菌中的具有良好益生作用的戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus  KLDS1.0413）和植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum KLDS1.0344）作为口服活载 体，将PLF基因与穿梭表达载体pPG612.1连接，穿梭表达载体pPG612.1的核苷 酸序列为SEQ No.2，构建了表达PLF蛋白的两种重组乳杆菌 pPG612.1-PLF/L.pentosus和pPG612.1-PLF/L.plantarum，将诱导表达升级到发酵罐 大量培养，以发酵培养的活菌作为饲料添加剂饲喂断乳仔猪，本发明可以替代抗生 素，乳铁蛋白还能刺激肠道细胞的生长，增加肠道中有益菌群，如双歧杆菌和乳酸 杆菌等数量，减少大肠杆菌等有害菌群的繁殖，从而保障仔猪肠道健康发育，增强 仔猪肠道对营养物质的消化、吸收能力，降低腹泻率，提高其生长性能，促进仔猪 生长。

附图说明

图1为重组戊糖乳杆菌KLDSl.0413Western blotting鉴定结果图，其中，M为 蛋白分子质量标准；1为经诱导的pPG612.1/L.pentosus；2为经诱导 pPG612.1-PLF/L.pentosus；3为经诱导的pPG612.1/L.pentosus发酵上清浓缩物；4 为经诱导的pPG612.1-PLF/L.pentosus培养发酵浓缩物；

图2为重组植物乳杆菌KLDSl.0344Western blotting鉴定结果图，其中，M为 蛋白分子质量标准；1为经诱导的pPG612.1/L.plantarum；2为经诱导 pPG612.1-PLF/L.plantarum；3为经诱导的pPG612.1/L.plantarum发酵液上清浓缩物； 4为经诱导的pPG612.1-PLF/L.plantarum发酵液上清浓缩物。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述 而更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域 技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的 细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

试验例1表达乳铁蛋白的两株重组乳酸菌的构建和发酵生产

PLF全基因序列由公司优化合成，两端分别有BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点。

pPG612.1质粒由实验室保存，质粒用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切，酶切反应体系 37℃水浴2h,用1%琼脂糖凝胶电泳分离后回3290bp的片段，用0.8%琼脂糖凝胶电 泳鉴定，鉴定正确的线性化pPG612.1与PLF全基因序列进行连接，体系于连接仪 中16℃连接过夜。

连接产物转化大肠杆菌TG1，在LB氯霉素（10μg/ml）选择性培养基平板上 37℃培养12～18h。挑取单菌，37℃振荡培养10h,用小量质粒DNA提取试剂盒提取 重组质粒，落通过单、双酶切和PCR方法鉴定，将提出的阳性克隆命名为 pPG612.1-PLF，送到北京博士生物技术有限公司进行测序。

测序正确后，将阳性重组质粒电转化到戊糖乳杆菌和植物乳杆菌中，成功构建 PLF两种乳杆菌原核表达载体，得到的重组菌中在发酵罐中发酵培养。

发酵罐及附属控制装置按照说明书进行组装，用PH4.14、6.86的校正液校正 PH计，配置2.5L的无糖MRS培养基于发酵罐中，将校正好的PH计插入指定位 置，用锡纸包上与导管连接口，将整个发酵罐放入灭菌锅内，湿热灭菌121℃， 30min；灭菌结束后连接冷凝水管，插入温度计，冷却至37℃；依次接入50mL的 50%果糖，两种重组乳杆菌混合菌液100ml；调控PH值6.4（用氨水自动调节PH）， 搅拌速度为50rpm，接通CO2气体；待菌液OD600约为0.6时，加入诱导剂。设定 程序，发酵6小时之后自动连续补加50%灭菌果糖，添加速率为每分钟泵0.5s；发 酵24h，无菌条件下收集菌液，用作饲料添加剂。

试验例2表达乳铁蛋白的检测

Western Blot检测蛋白表达

样品的处理：取发酵后的pPG612.1-PLF/L.pentosus和 pPG612.1-PLF/L.plantarum菌液以及作为对照的pPG612.1/L.pentosus和 pPG612.1/L.plantarum各1mL，5000r/min离心10min，分离上清液和菌体沉淀， 分开处理。

(1)取800μL上清液，加入400μL100%TCA冰上放置30min，4℃20000g离 心30min，弃净上清后用250μL丙酮清洗沉淀一次，用80μL50mM NaOH溶解 沉淀，再加入等体积的SDS-PAGE2×上样缓冲液（含DTT）100℃煮沸10min。

(2)向离心后的菌体沉淀中加入72μL的TER，37℃水浴30min，加入18μL 的20%SDS，溶液将从浑浊变澄清，100℃煮沸3min，再加入30μL的SDS-PAGE 4×上样缓冲液（含DTT）100℃煮沸10min。

Western-blot鉴定

兔抗PLF高免血清（1︰500稀释），37℃作用2h；羊抗兔IgG-HRP（1：2000 稀释），37℃作用2h后，在暗室条件下ECL显色(曝光2min，显影1min，定影5min)， 观察显色结果如图1和图2所示。

试验例3本发明与现有技术中仔猪饲料的比较

从猪场购买108头断奶仔猪（大白×长白；初始体重为5.66±0.09千克21±3d 的年龄），按照初始体重分成三个处理组，每组12头，分别为对照组(基础日粮)、 抗生素组(基础日粮+20mg/kg黄霉素+110mg/kg金霉素)和重组（recombinant）乳 铁蛋白(rPLF)组(基础日粮+发酵重组菌菌液)每组有三个重复。配制日粮，以满足 美国国家研究委员会（NRC）5-10公斤仔猪建议营养搭配，饲料和水可供仔猪自 由采食。其中发酵重组菌菌液量为：60ml浓度为2×107CFU/ml的两种重组菌发 酵液，实验期为30天。

1、发酵菌液饲喂仔猪后的生长表现

抗生素组和实验组仔猪生长状态良好，采食量较多，皮肤呈粉红色，毛顺而有 光泽，对照组仔猪采食量相对较少，有轻微腹泻状况发生，皮肤，毛缺乏光泽。

从开始饲喂重组菌之后的十四天中，称量仔猪的始末体重，每天记录仔猪的日 采食量。

与对照组相比,rPLF组平均日增重(ADG)增加(P<0.01)，平均日采食量 (ADFI)(P=0.013)增加，提高了饲料利用率(G/F)(P<0.01)；抗生素组ADG(P= 0.01)，ADFI(P=0.015)以及饲料利用率也显著增加。然而，rPLF组与抗生素组没 有显著差别，如表1所示。

表1重组猪乳铁蛋白对仔猪生长性能的影响

同行数据肩标不同小写字母a,b表示差异显著（Ｐ＜0.05），SEM是标准误，P-value是假设机率，表示 显著性。

2、发酵菌液饲喂仔猪后仔猪肠道菌群情况

试验开始14天后，从每组重复中随机选取2头体重接近平均体重、健康状况 较好的仔猪宰杀，解剖，剪取盲肠段，用线将盲肠两端扎紧，立即送入实验室进行 大肠杆菌、乳酸杆菌数量的测定和双歧杆菌数量的测定。用1g肠道内容物中细菌 数量的对数［log10(CFU)/g］表示。

结果表明，与对照组相比，rPLF和抗生素组仔猪肠道内的大肠杆菌(P=0.02) 减少,但这两组没有显著差别(P>0.05),乳酸菌总数(P=0.01)和双歧杆菌(P=0.005) 的总数显著增多，而抗生素组与对照组则没有明显差别，如表2所示。

表2重组猪乳铁蛋白对仔猪肠道菌群数量的影响

同行数据肩标不同小写字母a,b表示差异显著（Ｐ＜0.05），SEM是标准误，P-value是假设机率，表示 显著性。

3、免疫学指标检测

试验开始14天后，所有试验仔猪均从前腔静脉采血5～10mL，于37℃水浴中 静置至析出血清，3000r/min离心10min，分离血清分装于EP管中，置于-70℃低 温冰箱中保存备用。

从每组重复中选取两头健康状况良好的仔猪屠杀，取空肠起始端到回盲括约肌 肠管，用冷双蒸水和PBS依次流动冲洗后平铺于滤纸上，纵向剪开，暴露黏膜面， 4℃PBS冲洗，用清洁载玻片轻轻刮取肠黏膜表面粘液，用微量注射器收集刮取物 0.5mL左右，然后用4.5mL PBS稀释并小心搅拌，使其完全溶解，500g×4℃离心 5min，收集上清液。

ELISA检测：血清中lgG，IL-1，IL-2，IL-4以及肠液中的分泌抗体sIgA的测 定均采用北京诚林生物科技有限公司生产的免疫球蛋白试剂盒，采用双抗夹心 ELISA方法。酶标测定仪在波长490nm处测定每孔的光吸收值（OD490）。

实验结果表明：补充重组乳杆菌组仔猪与对照组和抗生素组相比，能有效增加 血清IgG（P=0.015）和IL-2（P=0.03）水平，并降低IL-4水平（P<0.001），而 对于上述指标抗生素组与对照组相比无显著性差异。rPLF组和抗生素组仔猪的分 泌型抗体sIgA水平（P=0.07）对照组相比有所升高，而这两组之间没有显著差 异。血液中的IL-1水平各组之间均无显著差异，如表3所示。

表3重组猪乳铁蛋白对仔猪细胞因子水平的影响

同行数据肩标不同小写字母a,b表示差异显著（Ｐ＜0.05），SEM是标准误，P-value是假设机率，表示 显著性。

4、腹泻性致病菌大肠杆菌K88+攻击后的保护效果

实验开始14天后，每组屠杀两头仔猪取样，剩下的仔猪进行腹泻性致病菌大 肠杆菌K88+攻毒保护试验。

每只仔猪口服7.2×1011CFU大肠杆菌K88+菌体。每天定时观察猪腹泻情况 以及新鲜粪便的形态，按评分标准打分，结果如表4所示。

表4腹泻评分标准参照表

隔天收集猪新鲜粪便，按每1g粪便加入2ml无菌PBS溶解粪便后，划线于麦 康凯平板，37℃静置培养12h后，每个平板随机挑取10个单菌落，以LTA的特异 性引物对其做PCR鉴定，检测猪持续外排K88+菌株的时间长度。

由实验结果可知，表达PLF的重组乳杆菌和抗生素添加饲料均对腹泻性致病 菌大肠杆菌K88+攻击后的仔猪有一定的保护作用，并能够抑制肠道内的腹泻性致 病菌大肠杆菌K88+增殖。

攻毒后rPLF组和抗生素组仔猪饮食正常，前几天有腹泻情况，但是很快好转， 对照组仔猪攻毒后出现严重腹泻，采食量减少，恢复时间较长，排菌时间较长，如 表5所示。

表5ETEC攻毒后各组仔猪的腹泻情况

本发明技术方案带来的有益效果：

本发明在乳杆菌中表达猪乳铁蛋白，无需纯化，可以直接添加到饲料中饲喂仔 猪，简化了传统的基因工程的步骤，又充分发挥了乳酸菌的益生作用。显著提高了 仔猪平均日增重以及饲料的利用率，是断乳仔猪有更好的生长表现。提高了断乳仔 猪肠道中乳酸菌和双歧杆菌两种益生菌的数量，降低了大肠杆菌的数量，维护了断 乳仔猪的肠道微生态健康，降低了发生腹泻的风险，另外，饲料中添加重组乳杆菌 还能显著提高仔猪血液中IgG，IL-2以及肠液中分泌型抗体sIgA的量，并减少了 IL-4的量,提高了断乳仔猪的免疫水平。

饲料里添加表达PLF的重组乳杆菌的效果可以和抗生素媲美，又避免了添加 抗生素造成的食品安全问题，为绿色畜牧业的生产提供新的健康生态友好型饲料添 加剂。

本文标签： 断乳乳酸菌组合仔猪蛋白