一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液、冷冻保存方法和应用

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本发明公开了一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液、冷冻保存方法和应用，玻璃化冷冻保存液包括基础液（BS）、平衡液（ES）和玻璃化液（VS），其中玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：10‑20%乙二醇（EG）、6‑10%二甲基亚砜（DMSO）、6‑10%丙二醇（PROH）、15‑25%灭活的胎牛血清（NCS）、8‑15%羧化ε‑聚赖氨酸（COOL‑PLL），其余部分为HEPES溶液；每升玻璃化液（VS）还包括0.3‑0.8mol的蔗糖。本发明的有益效果是：玻璃化冷冻保存液对细胞毒性低、渗透性强、玻璃化冷冻效果明显，同时显著降低冷冻和复温过程中冰晶的产生，保护细胞不受物理性损伤，提高了卵母细胞的存活率，非常适用于马、驴等马属动物卵母细胞或胚胎的玻璃化冷冻保存，有利于人工授精及胚胎移植技术的推广应用。

1.一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液，包括基础液（BS）、平衡液（ES）和玻璃化液（VS）3种液体，其特征在于，所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：10-20%乙二醇（EG）、6-10%二甲基亚砜（DMSO）、6-10%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、8-15%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.3-0.8mol的蔗糖。 2.根据权利要求1所述的马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液，其特征在于，所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：5-10%乙二醇（EG）、2-6%二甲基亚砜（DMSO）、2-6%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、2-8%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol/L蔗糖。 3.根据权利要求1所述的马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液，其特征在于，所述基础液（BS）由以下体积百分比的成分组成：15-25%灭活的胎牛血清和75-85%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成。 4.根据权利要求1-3任一项所述的马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液，其特征在于，所述玻璃化液（VS）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：10-20%乙二醇（EG）、6-10%二甲基亚砜（DMSO）、6-10%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、8-15%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.3-0.8mol的蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石；所述平衡液（ES）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：5-10%乙二醇（EG）、2-6%二甲基亚砜（DMSO）、2-6%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、2-8%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石。 5.根据权利要求1-4任一项所述的马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液，其特征在于，每升所述玻璃化液还添加有0.3-0.7g的维生素D；每升所述平衡液还添加有0.2-0.6g的维生素D。 6.一种如权利要求1-3任一项所述的马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液的使用方法，其特征在于，所述使用方法为：（1）将需要冷冻的卵母细胞或胚胎放于基础液（BS）中清洗1-2遍；（2）将清洗完毕的所述卵母细胞或胚胎转移至平衡液（ES）中平衡3-7分钟；（3）将平衡过的所述卵母细胞或胚胎迅速转移至玻璃化液（VS）中，再将含有卵母细胞或胚胎的玻璃化液迅速转移至一个封闭式拉长麦管(CPS管)中，并投入液氮在-196℃温度下保存，整个过程在1分钟内完成。 7.根据权利要求6所述的马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，所述基础液（BS）由以下体积百分比的成分组成：15-25%灭活的胎牛血清和75-85%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成；所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：5-10%乙二醇（EG）、2-6%二甲基亚砜（DMSO）、2-6%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、2-8%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol蔗糖；所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：10-20%乙二醇（EG）、6-10%二甲基亚砜（DMSO）、6-10%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、8-15%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.3-0.8mol的蔗糖。 8.根据权利要求6或7所述的马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，所述玻璃化液（VS）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：10-20%乙二醇（EG）、6-10%二甲基亚砜（DMSO）、6-10%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、8-15%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.3-0.8mol的蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石；所述平衡液（ES）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：5-10%乙二醇（EG）、2-6%二甲基亚砜（DMSO）、2-6%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、2-8%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol/L蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石。 9.根据权利要求6-8任一项所述的马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存方法，其特征在于，每升所述玻璃化液还添加有0.3-0.7g的维生素D；每升所述平衡液还添加有0.2-0.6g的维生素D。 10.一种如权利要求1-9任一项所述的马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液的应用，其特征在于，所述玻璃化冷冻保存液适用于所有马属动物卵母细胞及胚胎的冷冻保存。

技术领域

本发明属于动物卵母细胞及胚胎的冷冻保存技术领域，特别是涉及一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液、冷冻保存方法和应用。

背景技术

卵母细胞冷冻保存是指将收集的卵母细胞在超低温（-196℃液氮）条件下保存，使其代谢活动停止，处于休眠状态，当外界环境达到适宜条件后又可以继续授精发育成健康胚胎的一种保存技术。卵母细胞冷冻保存技术可以为建立优良品种卵母细胞库或基因库提供条件；使因疾病或其他原因丢失的各种动物品种、品系和珍惜濒危动物得以保持；可以实现简便廉价的远距离运输，方便国际间引种；它代替运输活畜，节省大量时间和资金，还可以减少活畜运输时传播疾病的危险。

卵母细胞冷冻保存首次成功是1977年Whittingham冷冻成熟的小鼠卵母细胞，近几年已涉及的哺乳动物包括兔、山羊、牛、猪及人类等，但马属动物的卵母细胞冷冻保存鲜有报道。卵母细胞冷冻液及冷冻保存方法主要借鉴了胚胎冷冻保存液及冷冻保存方法，但是由于卵母细胞结构特殊、体积较大、冷冻时不易充分脱水等特点，其冷冻保存一直较为困难。Nakagata用玻璃化冷冻法冷冻小鼠成熟卵母细胞并取得成功后，玻璃化冷冻方法被广泛用于各种卵母细胞的冷冻保存研究。

玻璃化冷冻保存的关键是玻璃化冷冻保护剂，是细胞能够成功冷冻的关键因素，其原理是利用高浓度冷冻保护剂在受冻固化时粘度极度增加的特点，使液态变为无结构的玻璃化状态，同时降低损伤性溶液的浓度，增加非冷冻部分，减少冻融过程中冰晶的产生及卵母细胞或胚胎体积的波动，减少渗透压和激冷对细胞的损伤，提高卵母细胞或胚胎的复苏率。目前现有的玻璃化冷冻保护剂组分比较单一，对细胞毒性较大，降温和复温过程中抑制冰晶生成效果较差，对细胞的损伤较大，导致卵母细胞或胚胎的复苏率相对偏低。

发明内容

为解决马属动物卵母细胞及胚胎冷冻保存过程中冰晶对细胞造成的化学、物理损伤及冷冻液对细胞毒性等问题，提高卵母细胞或胚胎的复苏率，本发明提供一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液及其制备方法、冷冻保存方法和应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供了一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液，包括基础液（BS）、平衡液（ES）和玻璃化液（VS）3种液体，所述玻璃化液（VS）各组分的含量为：10-20%乙二醇（EG）、6-10%二甲基亚砜（DMSO）、6-10%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、0.3-0.8mol/L蔗糖、8-15%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液。

所述平衡液（ES）各组分的含量为：5-10%乙二醇（EG）、2-6%二甲基亚砜（DMSO）、2-6%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、0.1-0.3mol/L蔗糖、2-8%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液。

所述基础液（BS）由体积分数为15-25%灭活的胎牛血清和75-85%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成；优选地，所述基础液（BS）由体积分数为20%灭活的胎牛血清和80%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成。

所述乙二醇（EG）的分子式为C2H6O2；所述二甲基亚砜（DMSO）的分子式为(CH3)2SO；所述丙二醇（PROH）的分子式为C3H8O2；所述蔗糖的分子式为C12H22O11；所述羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL）的分子式为C181H362N60O33；所述HEPES的分子式为C8H18N2O4S；所述羟基磷灰石的分子式为Ca10(PO4)6(OH)2。

优选地，所述玻璃化液（VS）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：10-20%乙二醇（EG）、6-10%二甲基亚砜（DMSO）、6-10%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、8-15%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.3-0.8mol的蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石；

所述平衡液（ES）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：5-10%乙二醇（EG）、2-6%二甲基亚砜（DMSO）、2-6%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、2-8%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol/L蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石。

优选地，所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：12-17%乙二醇（EG）、7-9%二甲基亚砜（DMSO）、7-9%丙二醇（PROH）、18-21%灭活的胎牛血清（NCS）、10-13%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.4-0.7mol的蔗糖和2-4g粒径为40nm的羟基磷灰石；

所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：6-8%乙二醇（EG）、3-5%二甲基亚砜（DMSO）、3-5%丙二醇（PROH）、17-22%灭活的胎牛血清（NCS）、4-7%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol/L蔗糖和2-4g粒径为40nm的羟基磷灰石。

所述玻璃化液（VS）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：10-20%乙二醇（EG）、6-10%二甲基亚砜（DMSO）、6-10%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、8-15%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.3-0.8mol的蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石；

所述平衡液（ES）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：5-10%乙二醇（EG）、2-6%二甲基亚砜（DMSO）、2-6%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、2-8%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol/L蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石。

优选地，每升所述玻璃化液还添加有0.3-0.7g的维生素D；每升所述平衡液还添加有0.2-0.6g的维生素D；更进一步的，所述玻璃化液和所述平衡液中添加的维生素D为维生素D2。

其中，所述玻璃化液（VS）、所述平衡液（ES）和所述基础液（BS）的配制方法具体如下：

所述玻璃化液（VS）的配制方法为：按照所述体积分数比向所述HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，即可得到所述玻璃化液（VS）。

所述平衡液（ES）的配制方法为：按照所述体积分数比向所述HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，即可得到所述平衡液（ES）。

所述基础液（BS）的配制方法：将所述灭活的胎牛血清（NCS）按照所述体积分数比加入到所述HEPES溶液中，即可得到所述基础液（BS）。

为了更好的实现上述发明目的，本发明还提供了一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存方法，所述保存方法为：

（1）将需要冷冻的卵母细胞或胚胎放于基础液（BS）中清洗1-2遍；

（2）将清洗完毕的所述卵母细胞或胚胎转移至平衡液（ES）中平衡3-7分钟；优选地，将清洗完毕的所述卵母细胞或胚胎转移至平衡液（ES）中平衡5分钟；

（3）将平衡过的所述卵母细胞或胚胎迅速转移至玻璃化液（VS）中，再将含有卵母细胞或胚胎的玻璃化液迅速转移至一个封闭式拉长麦管(CPS管)中，并投入液氮在-196℃温度下保存，整个此过程在1分钟内完成。

其中，所述基础液（BS）由以下体积百分比的成分组成：15-25%灭活的胎牛血清和75-85%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成；优选地，所述基础液（BS）由体积分数为20%灭活的胎牛血清和80%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成。

所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：5-10%乙二醇（EG）、2-6%二甲基亚砜（DMSO）、2-6%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、2-8%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol/L蔗糖；

所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：10-20%乙二醇（EG）、6-10%二甲基亚砜（DMSO）、6-10%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、8-15%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.3-0.8mol的蔗糖。

进一步地，所述玻璃化液（VS）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：10-20%乙二醇（EG）、6-10%二甲基亚砜（DMSO）、6-10%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、8-15%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.3-0.8mol的蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石；优选地，所述玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：12-17%乙二醇（EG）、7-9%二甲基亚砜（DMSO）、7-9%丙二醇（PROH）、18-21%灭活的胎牛血清（NCS）、10-13%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述玻璃化液（VS）还包括0.4-0.7mol的蔗糖和2-4g粒径为40nm的羟基磷灰石；

所述平衡液（ES）还包括粒径为40nm的羟基磷灰石；所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：5-10%乙二醇（EG）、2-6%二甲基亚砜（DMSO）、2-6%丙二醇（PROH）、15-25%灭活的胎牛血清（NCS）、2-8%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol蔗糖和1-5g粒径为40nm的羟基磷灰石；优选地，所述平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：6-8%乙二醇（EG）、3-5%二甲基亚砜（DMSO）、3-5%丙二醇（PROH）、17-22%灭活的胎牛血清（NCS）、4-7%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升所述平衡液（ES）还包括0.1-0.3mol蔗糖和2-4g粒径为40nm的羟基磷灰石。

优选地，每升所述玻璃化液还添加有0.3-0.7g的维生素D；每升所述平衡液还添加有0.2-0.6g的维生素D；更进一步的，所述玻璃化液和所述平衡液中添加的维生素D为维生素D2。

其中，所述玻璃化液（VS）、所述平衡液（ES）和所述基础液（BS）的配制方法具体如下：

所述玻璃化液（VS）的配制方法为：按照所述体积分数比向所述HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，即可得到所述玻璃化液（VS）。

所述平衡液（ES）的配制方法为：按照所述体积分数比向所述HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，即可得到所述平衡液（ES）。

所述基础液（BS）的配制方法：将所述灭活的胎牛血清（NCS）按照所述体积分数比加入到所述HEPES溶液中，即可得到所述基础液（BS）。

本发明还提供了一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液的应用，所述玻璃化冷冻保存液适用于马、驴等所有马属动物卵母细胞及胚胎的冷冻保存；更进一步的，所述玻璃化冷冻保存液并不仅限用于马、驴等所有马属动物卵母细胞及胚胎的冷冻保存。

本发明的有益效果是：玻璃化冷冻保存液对细胞毒性低、渗透性强、玻璃化冷冻效果明显，同时显著降低冷冻和复温过程中冰晶的产生，保护细胞不受物理性损伤，提高了卵母细胞的存活率，非常适用于马、驴等马属动物卵母细胞或胚胎的玻璃化冷冻保存，有利于人工授精及胚胎移植技术的推广应用。

具体实施方式

为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本方案进行阐述。

实施例1 冷冻液一

本发明实施例提供了一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液， 包括基础液（BS）、平衡液（ES）和玻璃化液（VS）3种液体；其中，

基础液（BS）由体积分数为20%灭活的胎牛血清和体积分数为80%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成；配制方法为：在无菌环境下，按照体积百分比取灭活的胎牛血清（NCS）加入HEPES溶液中，并溶解摇匀，制得10ml基础液（BS）。

平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：8%乙二醇（EG）、4%二甲基亚砜（DMSO）、4%丙二醇（PROH）、20%灭活的胎牛血清（NCS）、5%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升平衡液（ES）还包括0.25mol蔗糖；配制方法为：按照体积分数比向HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，制得100ml平衡液（ES），置于4℃冰箱备用。

玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：16%乙二醇（EG）、8%二甲基亚砜（DMSO）、8%丙二醇（PROH）、20%灭活的胎牛血清（NCS）、10%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升玻璃化液（VS）还包括0.5mol的蔗糖；配置方法为：按照体积分数比向HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，制得10ml玻璃化液（VS），置于4℃冰箱备用。

使用本实施例玻璃化冷冻保存液对马属动物卵母细胞进行玻璃化冷冻保存。

实施例2 冷冻液二

本发明实施例提供了一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液， 包括基础液（BS）、平衡液（ES）和玻璃化液（VS）3种液体；其中，

基础液（BS）由体积分数为20%灭活的胎牛血清和体积分数为80%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成；配制方法为：在无菌环境下，按照体积百分比取灭活的胎牛血清（NCS）加入HEPES溶液中，并溶解摇匀，制得10ml基础液（BS）。

平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：8%乙二醇（EG）、4%二甲基亚砜（DMSO）、4%丙二醇（PROH）、20%灭活的胎牛血清（NCS）、5%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升平衡液（ES）还包括0.25mol蔗糖和3g粒径为40nm的羟基磷灰石；配制方法为：按照体积分数比向HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，制得100ml平衡液（ES），置于4℃冰箱备用。

玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：16%乙二醇（EG）、8%二甲基亚砜（DMSO）、8%丙二醇（PROH）、20%灭活的胎牛血清（NCS）、10%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升玻璃化液（VS）还包括0.5mol的蔗糖和4g粒径为40nm的羟基磷灰石；配置方法为：按照体积分数比向HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，制得10ml玻璃化液（VS），置于4℃冰箱备用。

使用本实施例玻璃化冷冻保存液对马属动物卵母细胞进行玻璃化冷冻保存。

实施例3 冷冻液三

本发明实施例提供了一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液，包括基础液（BS）、平衡液（ES）和玻璃化液（VS）3种液体；其中，

基础液（BS）由体积分数为20%灭活的胎牛血清和体积分数为80%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成；配制方法为：在无菌环境下，按照体积百分比取灭活的胎牛血清（NCS）加入HEPES溶液中，并溶解摇匀，制得10ml基础液（BS）。

平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：8%乙二醇（EG）、4%二甲基亚砜（DMSO）、4%丙二醇（PROH）、20%灭活的胎牛血清（NCS）、5%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升平衡液（ES）还包括0.25mol蔗糖和0.3g维生素D2；配制方法为：按照体积分数比向HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，制得100ml平衡液（ES），置于4℃冰箱备用。

玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：16%乙二醇（EG）、8%二甲基亚砜（DMSO）、8%丙二醇（PROH）、20%灭活的胎牛血清（NCS）、10%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升玻璃化液（VS）还包括0.5mol的蔗糖和0.5g维生素D2；配置方法为：按照体积分数比向HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，制得10ml玻璃化液（VS），置于4℃冰箱备用。

使用本实施例玻璃化冷冻保存液对马属动物卵母细胞进行玻璃化冷冻保存。

实施例4 冷冻液四

本发明实施例提供了一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存液， 包括基础液（BS）、平衡液（ES）和玻璃化液（VS）3种液体；其中，

基础液（BS）由体积分数为20%灭活的胎牛血清和体积分数为80%浓度为10mmol/L的HEPES溶液组成；配制方法为：在无菌环境下，按照体积百分比取灭活的胎牛血清（NCS）加入HEPES溶液中，并溶解摇匀，制得10ml基础液（BS）。

平衡液（ES）由以下体积百分比的成分组成：8%乙二醇（EG）、4%二甲基亚砜（DMSO）、4%丙二醇（PROH）、20%灭活的胎牛血清（NCS）、5%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升平衡液（ES）还包括0.25mol蔗糖、2g粒径为40nm的羟基磷灰石和0.4g维生素D2；配制方法为：按照体积分数比向HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，制得100ml平衡液（ES），置于4℃冰箱备用。

玻璃化液（VS）由以下体积百分比的成分组成：16%乙二醇（EG）、8%二甲基亚砜（DMSO）、8%丙二醇（PROH）、20%灭活的胎牛血清（NCS）、10%羧化ε-聚赖氨酸（COOL-PLL），其余部分为10mmol/L浓度的HEPES溶液；每升玻璃化液（VS）还包括0.5mol的蔗糖、3g粒径为40nm的羟基磷灰石和0.6g维生素D2；配置方法为：按照体积分数比向HEPES溶液中加入各成分，溶解摇匀后过滤除菌，制得10ml玻璃化液（VS），置于4℃冰箱备用。

使用本实施例玻璃化冷冻保存液对马属动物卵母细胞进行玻璃化冷冻保存。

实施例5 冷冻方法

本发明实施例提供了一种马属动物卵母细胞玻璃化冷冻保存方法，冷冻保存方法具体为：

（1）将需要冷冻的卵母细胞或胚胎放于基础液（BS）中清洗1-2遍；

（2）将清洗完毕的所述卵母细胞或胚胎转移至平衡液（ES）中平衡5分钟；

（3）将平衡过的所述卵母细胞或胚胎迅速转移至玻璃化液（VS）中，再将含有卵母细胞或胚胎的玻璃化液迅速转移至一个封闭式拉长麦管(CPS管)中，并投入液氮中（-196℃）保存，整个此过程在1分钟内完成。

其中，上述基础液（BS）、平衡液（ES）和玻璃化液（VS）可以为实施例1-4中的任意一种。

对比实验一：

利用本公司母马经超数排卵获得的100枚卵母细胞进行实验，其中100枚卵母细胞均形态正常且无明显空泡及碎片等，将100枚卵母细胞随机分成5组，每组20枚，分别使用实施例1（实施例1组）、实施例2（实施例2组）、实施例3（实施例3组）和实施例4（实施例4组）的玻璃化冷冻保存液和传统玻璃化冷冻液（传统对照组）按照实施例5的方法进行冷冻保存。

其中，所使用的传统玻璃化冷冻液的组分为：基础液包含体积分数20%灭活的胎牛血清和80%的PBS液；平衡液包含体积分数80%的基础液、10%乙二醇（EG）和10%的二甲基亚砜（DMSO）；玻璃化液包含体积分数60%基础液、20%乙二醇（EG）、20%二甲基亚砜（DMSO）和0.65mol/L蔗糖。

冷冻保存4周，取出解冻后，观察透明带完整率和卵母细胞存活率（卵母细胞存活标准：没有明显的胞浆溢出与皱缩、细胞膜完整、卵周间隙清晰、卵母细胞大小正常）及卵母细胞的受精率（卵母细胞受精的标准：行ICSI后18-20小时卵母细胞胞浆内见到两个原核）。结果见表1。

表1 透明带完整率、卵母细胞存活率及受精率对照表

组别 使用卵数（枚） 透明带完整数（枚） 透明带完整率（%） 存活数（枚） 存活率（%） 受精数（枚） 受精率（%） 传统对照组 20 16 80 15 75 15 75 实施例1组 20 18 90 17 85 16 80 实施例2组 20 19 95 18 90 17 85 实施例3组 20 18 90 17 85 17 85 实施例4组 20 20 100 19 95 18 90

由表1的数据可知，与传统对照组相比，实施例1组、实施例2组、实施例3组和实施例4组无论在透明带完整率、卵母细胞的存活率还是在卵母细胞的受精率方面都要高于传统对照组。

对比实验二：

利用本公司母马经超数排卵获得的100枚卵母细胞进行实验，其中100枚卵母细胞均形态正常且无明显空泡及碎片等，将100枚卵母细胞随机分成5组，每组20枚，分别使用实施例1（实施例1组）、实施例2（实施例2组）、实施例3（实施例3组）和实施例4（实施例4组）的玻璃化冷冻保存液和传统玻璃化冷冻液（传统对照组）按照实施例5的方法进行冷冻保存。

其中，所使用的传统玻璃化冷冻液的组分为：基础液包含体积分数20%灭活的胎牛血清和80%的PBS液；平衡液包含体积分数80%的基础液、10%乙二醇（EG）和10%的二甲基亚砜（DMSO）；玻璃化液包含体积分数60%基础液、20%乙二醇（EG）、20%二甲基亚砜（DMSO）和0.65mol/L蔗糖。

冷冻保存1年，取出解冻后，观察透明带完整率和卵母细胞存活率（卵母细胞存活标准：没有明显的胞浆溢出与皱缩、细胞膜完整、卵周间隙清晰、卵母细胞大小正常）及卵母细胞的受精率（卵母细胞受精的标准：行ICSI后18-20小时卵母细胞胞浆内见到两个原核）。结果见表2。

表2 透明带完整率、卵母细胞存活率及受精率对照表

组别 使用卵数（枚） 透明带完整数（枚） 透明带完整率（%） 存活数（枚） 存活率（%） 受精数（枚） 受精率（%） 传统对照组 20 15 75 14 70 14 70 实施例1组 20 17 85 17 85 16 80 实施例2组 20 18 90 18 90 17 85 实施例3组 20 18 90 17 85 16 80 实施例4组 20 19 95 19 95 18 90

由表2的数据可知，与传统对照组相比，实施例1组、实施例2组、实施例3组和实施例4组无论在透明带完整率、卵母细胞的存活率还是在卵母细胞的受精率方面都要高于传统对照组。

综上所述，本发明方案的卵母细胞玻璃化冷冻保存方面效果明显优于传统玻璃化冷冻保存液，非常适用于马、驴等马属动物卵母细胞和胚胎的玻璃化冷冻保存，有利于人工授精及胚胎移植技术的推广应用。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本文标签： 种马细胞动物方法玻璃化