4松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法及其培养基

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本发明公开了一种4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，该法选择4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌，采集萌芽条，先后经特定设计的初代诱导培养基和继代增殖培养基培养。实验表明，应用本发明可以提高芽器官繁殖系数，缩短芽器官继代增殖周期，增加有效芽数，从而降低4-松油醇型互叶白千层组培产业化育苗中的生产成本；由于外植体采自4-松油醇型互叶白千层优良单株，其组培苗保持了母本优良的遗传性状，使白千层种苗达到良种化和无性系化，可增加单位面积的生物量和产油量，提高白千层林分的经济效益和生态效益。

1.一种4-松油醇型互叶白千层组培培养基，其特征在于为初代诱导培养基，该培养基的配方为改良MS+6-BA2.5mg·L+蔗糖30000mg·L+琼脂3000mg·L。 2.一种4-松油醇型互叶白千层组培培养基，其特征在于为继代增殖培养基，该培养基的配方为改良MS+6-BA1.5～2.0mg·L+NAA0.6～1.0mg·L+蔗糖30000mg·L+琼脂3500mg·L。 3.权利要求1或2所述4-松油醇型互叶白千层组培培养基，其特征在于所述改良MS培养基的组成为： 4.使用权利要求3所述组培培养基的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于选择4-松油醇型互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌，采集萌芽条，先后经初代诱导培养基和继代增殖培养基培养。 5.根据权利要求4所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于包括以下步骤：<1>优良单株的选择；<2>初始芽的获取；<3>芽器官的继代增殖培养。 6.根据权利要求5所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于步骤<1>按以下操作进行：选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到“茶树油”国际标准ISO4730-2004。 7.根据权利要求5所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于步骤<2>按以下操作进行：在前一年的11月～12月，对选择出的优良单株进行伐桩或者环割促萌；当年采集萌芽条，去除叶片，剪切成3cm～6cm的小段，酒精、升汞消毒处理，而后无菌水冲洗，接种到初代诱导培养基上。 8.根据权利要求5所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于步骤<3>按以下操作进行：待初代芽长度≥1.5cm时，转入继代增殖培养；芽体转入继代增殖培养基后，平摊在培养基上，芽体部分压入培养基中。 9.根据权利要求7或8所述的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，其特征在于：所述初代诱导培养或继代增殖培养的培养条件为28～30℃，1500～2500LX，每天光照12～14h。

技术领域

本发明属于互叶白千层组织培养育苗技术领域，尤其涉及一种4-松油醇型互叶白千 层组培继代增殖方法及其培养基。

背景技术

互叶白千层(MelaleucaalternifoliaLinn)系桃金娘科(Myrtaceae)白千层 (Melateuca)属植物，俗称茶树，常绿灌木至小乔木，原产于澳大利亚东部的昆士兰州和 新南威尔士北部。由于互叶白千层枝叶中含有α-松油烯、桉叶素、γ-松油烯、4-松油醇 等挥发性成分，长期以来作为香料植物在澳洲广为种植。不同生化类型的互叶白千层油价 格差异大，用途也不同；4-松油醇型互叶白千层油，就是常说的茶树油，价值最高；桉 叶素型互叶白千层油次之；其他两种类型利用价值不高，属淘汰产品。20世纪90年代 初，由于认识到茶树油的重要商业价值，我国开始引进互叶白千层，陆续在广东、广西、 福建、海南、云南、贵州等地大面积种植。

茶树油为无色至淡黄色透明油状液体，具有令人愉快的豆蔻气味，是公认的优良天然 芳香剂、抗菌剂、防腐剂，2002年被收入欧洲和英国药典。当前，茶树油在农用杀菌剂、 日用卫生制品、皮肤保健品、化妆品、食品香料、药品等行业中已开始广泛试用或应用。 目前，国际上对茶树油的需要量极大，价格稳定，国内市场的需求量也在不断增长。种植 和加工4-松油醇型互叶白千层已成为一个新兴产业，做为一个短平快的项目可帮助林农 脱贫致富。此外，该树种还可用作绿化，因此其种植集经济效益、社会效益和生态效益于 一身。

为满足茶树油市场需求，4-松油醇型互叶白千层的种植面积不断扩大，对优良种苗 的迫切需求随之而来。互叶白千层种子小，发芽率仅10％，且产量低，难以满足生产的需 要。同时，种子苗个体间遗传分化大，单株生物量，精油含量和成分参差不齐，从而制约 了精油生产量的提高。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种增殖周期短、繁殖效果好、生产成本低的4-松 油醇型互叶白千层组培继代增殖方法及其培养基，所得4-松油醇型互叶白千层组培苗遗 传性状优良稳定。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：4-松油醇型互叶白千层组培培养 基为初代诱导培养基，该培养基的配方为改良MS+6-BA2.5mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼 脂3000mg·L-1。

4-松油醇型互叶白千层组培培养基为继代增殖培养基，该培养基的配方为改良 MS+6-BA1.5～2.0mg·L-1+NAA0.6～1.0mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3500mg·L-1。

改良MS培养基的组成为：

使用上述组培培养基的4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，选择4-松油醇型 互叶白千层优良单株进行伐桩或者环割促萌，采集萌芽条，先后经初代诱导培养基和继代 增殖培养基培养。

上述4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，包括以下步骤：

<1>优良单株的选择；

<2>初始芽的获取；

<3>芽器官的继代增殖培养。

步骤<1>按以下操作进行：选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株， 其精油指标达到“茶树油”国际标准IS04730-2004。

步骤<2>按以下操作进行：在前一年的11月～12月，对选择出的优良单株进行伐桩或 者环割促萌；当年采集萌芽条，去除叶片，剪切成3cm～6cm的小段，酒精、升汞消毒处 理，而后无菌水冲洗，接种到初代诱导培养基上。

步骤<3>按以下操作进行：待初代芽长度≥1.5cm时，转入继代增殖培养；芽体转入继 代增殖培养基后，平摊在培养基上，芽体部分压入培养基中。

初代诱导培养或继代增殖培养的培养条件为28～30℃，1500～2500LX，每天光照12～ 14h。

为满足对4-松油醇型互叶白千层优良种苗的需求以供给大规模栽培，发明人在优良 单株选择的基础上，探索通过组培快繁生产大量遗传性状一致的4-松油醇型互叶白千层 优质苗，克服了组培技术的关键环节——继代增殖，从而建立了一种4-松油醇型互叶白 千层组培继代增殖方法，并研制了相应的组培培养基。该法选择4-松油醇型互叶白千层 优良单株进行伐桩或者环割促萌，采集萌芽条，先后经特定设计的初代诱导培养基和继代 增殖培养基培养。实验表明，应用本发明可以提高芽器官繁殖系数(达5.7～7.4)，缩短 芽器官继代增殖周期(仅需30d)，增加有效芽数(5.2～6.8个)，从而降低4-松油醇型 互叶白千层组培产业化育苗中的生产成本；由于外植体采自4-松油醇型互叶白千层优良 单株，其组培苗保持了母本优良的遗传性状，使白千层种苗达到良种化和无性系化，可增 加单位面积的生物量和产油量，提高白千层林分的经济效益和生态效益。

具体实施方式

以下各例中，初代诱导培养或继代增殖培养的培养条件为28～30℃，1500～2500LX， 每天光照12～14h。改良MS培养基的组成为：

实施例1

<1>优良单株的选择

选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到“茶树油” 国际标准IS04730-2004，其4-松油醇含量＞35％，1，8-桉叶素含量＜5％。

<2>初始芽的获取

2.1、外植体的采集

在优良单株选出的基础上，在前一年的11月～12月，对选择出的4-松油醇型互叶白 千层优良单株进行伐桩或者环割促萌(割树周长的1/2)，割伤至韧皮部。萌芽条生长至 30～40cm时，于晴天午后采集接种。

2.2、外植体消毒

将采回的枝条去除叶片后，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净，再用 沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，后用去离子水清洗3次，剪切成3cm～6cm的小 段。用75％乙醇浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗3次后置于超净台，将0.1％HgCl2倒入装有 外植体的瓶中，以浸泡的方式静置5min，用无菌水冲洗3次；然后再倒入0.1％HgCl2，以 振荡的方式进行灭菌处理3min，最后用无菌水冲洗3次。

2.3、茎段的初始培养

将消毒好的茎段接种到初代诱导培养基上进行诱导培养。培养10d后腋芽开始萌动， 培养30d芽高3～5cm时，把茎段剪下进行丛生芽诱导。经过30d的培养，每个外植体 形成一个或多个无菌初始芽，用于互叶白千层芽器官继代增殖培养。

初代诱导培养基配方为改良MS+6-BA2.5mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3000mg·L-1。

<3>芽器官的继代增殖培养

待无菌初代芽长度≥1.5cm时，选取生长较健壮的转入继代增殖培养，初代芽长度＜ 1.5cm，则待其继续生长，待长度≥1.5cm再转入继代增殖培养；初代芽较长的，可剪切为 几段，每段长度≥1.5cm；分段或者不分段的芽体转入继代增殖培养基后，均平摊在培养 基上，芽体部分压入培养基中，以便其吸收营养；芽与芽之间不交叉，不重叠，以免先长 起来的芽将上面的芽顶起，导致其吸收不到营养而死亡。

继代增殖培养基配方为改良MS+6-BA1.5mg·L-1+NAA0.6mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼 脂3500mg·L-1。

经过30d培养，增殖系数达到5.7，有效芽5.2个(有效芽指高度≥1.0cm，生长健 壮的芽)。

实施例2

<1>优良单株的选择

选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到“茶树油” 国际标准IS04730-2004，其4-松油醇含量＞35％，1，8-桉叶素含量＜5％。

<2>初始芽的获取

2.1、外植体的采集

在优良单株选出的基础上，在前一年的11月～12月，对选择出的4-松油醇型互叶白 千层优良单株进行伐桩或者环割促萌(割树周长的2/3)，割伤至韧皮部。萌芽条生长至 30～40cm时，于晴天午后采集接种。

2.2、外植体消毒

将采回的枝条去除叶片后，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净，再用 沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，后用去离子水清洗4次，剪切成3cm～6cm的小 段。用75％乙醇浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗4次后置于超净台，将0.1％HgCl2倒入装有 外植体的瓶中，以浸泡的方式静置6min，用无菌水冲洗4次；然后再倒入0.1％HgCl2， 以振荡的方式进行灭菌处理4min，最后用无菌水冲洗4次。

2.3、茎段的初始培养

将消毒好的茎段接种到初代诱导培养基上进行诱导培养。培养10d后腋芽开始萌动， 培养30d芽高3～5cm时，把茎段剪下进行丛生芽诱导。经过30d的培养，每个外植体 形成一个或多个无菌初始芽，用于互叶白千层芽器官继代增殖培养。

初代诱导培养基配方为改良MS+6-BA2.5mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3000mg·L-1。

<3>芽器官的继代增殖培养

待无菌初代芽长度≥1.5cm时，选取生长较健壮的转入继代增殖培养，初代芽长度＜ 1.5cm，则待其继续生长，待长度≥1.5cm再转入继代增殖培养；初代芽较长的，可剪切为 几段，每段长度≥1.5cm；分段或者不分段的芽体转入继代增殖培养基后，均平摊在培养 基上，芽体部分压入培养基中，以便其吸收营养；芽与芽之间不交叉，不重叠，以免先长 起来的芽将上面的芽顶起，导致其吸收不到营养而死亡。

继代增殖培养基配方为改良MS+6-BA1.75mg·L-1+NAA0.8mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+ 琼脂3500mg·L-1。

经过30d培养，增殖系数达到6.6，有效芽6.0个(有效芽指高度≥1.0cm，生长健 壮的芽)。

实施例3

<1>优良单株的选择

选择互叶白千层实生林内高生物量、高含油率的优良单株，其精油指标达到“茶树油” 国际标准IS04730-2004，其4-松油醇含量＞35％，1，8-桉叶素含量＜5％。

<2>初始芽的获取

2.1、外植体的采集

在优良单株选出的基础上，在前一年的11月～12月，对选择出的4-松油醇型互叶白 千层优良单株进行伐桩或者环割促萌(环割一整周)，割伤至韧皮部。萌芽条生长至30～ 40cm时，于晴天午后采集接种。

2.2、外植体消毒

将采回的枝条去除叶片后，用清水将附着于枝条表面的泥土等污染物清洗干净，再用 沾有肥皂粉或洗洁精的软毛刷进行刷洗，后用去离子水清洗5次，剪切成3cm～6cm的小 段。用75％乙醇浸泡灭菌30s，蒸馏水冲洗5次后置于超净台，将0.1％HgCl2倒入装有 外植体的瓶中，以浸泡的方式静置8min，用无菌水冲洗5次；然后再倒入0.1％HgCl2， 以振荡的方式进行灭菌处理5min，最后用无菌水冲洗5次。

2.3、茎段的初始培养

将消毒好的茎段接种到初代诱导培养基上进行诱导培养。培养10d后腋芽开始萌动， 培养30d芽高3～5cm时，把茎段剪下进行丛生芽诱导。经过30d的培养，每个外植体 形成一个或多个无菌初始芽，用于互叶白千层芽器官继代增殖培养。

初代诱导培养基配方为改良MS+6-BA2.5mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼脂3000mg·L-1。

<3>芽器官的继代增殖培养

待无菌初代芽长度≥1.5cm时，选取生长较健壮的转入继代增殖培养，初代芽长度＜ 1.5cm，则待其继续生长，待长度≥1.5cm再转入继代增殖培养；初代芽较长的，可剪切为 几段，每段长度≥1.5cm；分段或者不分段的芽体转入继代增殖培养基后，均平摊在培养 基上，芽体部分压入培养基中，以便其吸收营养；芽与芽之间不交叉，不重叠，以免先长 起来的芽将上面的芽顶起，导致其吸收不到营养而死亡。

继代增殖培养基配方为改良MS+6-BA2.0mg·L-1+NAA1.0mg·L-1+蔗糖30000mg·L-1+琼 脂3500mg·L-1。

经过30d培养，增殖系数达到7.4，有效芽6.8个(有效芽指高度≥1.0cm，生长健 壮的芽)。

应用本发明4-松油醇型互叶白千层组培继代增殖方法，经过一代及以上代数继代增 殖培养的芽器官的继代增殖剪切方式及继代增殖培养基、培养条件均与初代芽相同；其中， 继代增殖芽体采用横卧、平铺的方式，操作较单芽直立插入更简单。以增殖为目的的继代 增殖培养基可在一定范围内选择细胞分裂素较高，生长素较低的组合。而一边进行继代增 殖一边还需进行单芽生根，可在一定范围内选择细胞分裂素较低，生长素较高的组合。

本文标签： 松油培养基千层方法组培