利用重组过氧化物酶A4PRX脱毒玉米酒糟生产饲料的方法

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本发明公开了一种利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，该方法包括如下步骤：（1）制备重组过氧化物酶液A4-Prx：将重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4-Prx接种于LB培养基中，摇床培养至其OD600值大于0.5，添加IPTG继续诱导培养4-5h，然后离心收集细胞后洗涤、重悬，超声波破碎细胞后，离心收集上清液即为粗酶液；（2）饲料的制备：将步骤（1）的粗酶液与玉米DDGS混合，反应并烘干后得到安全的、无毒的饲料。采用本发明的方法，可降解DDGS中98%以上的ZEA毒素，使玉米酒糟或其他有毒饲料成为安全的饲料，实现了工业残渣的高值化利用。

1.一种利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，其特征在于包括如下步骤：（1）制备重组过氧化物酶液A4-Prx：将重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4-Prx接种于LB培养基中，摇床培养至其OD值大于0.5，添加IPTG继续诱导培养4-5h，然后离心收集细胞后洗涤、重悬，超声波破碎细胞后，离心收集上清液即为粗酶液；（2）饲料的制备：将步骤（1）的粗酶液与玉米DDGS混合，反应并烘干后得到安全的、无毒的饲料。 2.根据权利要求1所述的利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，其特征在于：步骤（1）所述的LB培养基中含有50μg/mL的氨苄青霉素。 3.根据权利要求1所述的利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，其特征在于：步骤（1）所述的添加IPTG为添加至IPTG的终浓度为0.5mM。 4.根据权利要求1所述的利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，其特征在于：步骤（1）所述的粗酶液中的过氧化物酶酶活大于300U/mL。 5.根据权利要求1所述的利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，其特征在于：步骤（2）中，将粗酶液与玉米DDGS混合之前，每0.1kg玉米DDGS要添加1.5L NaCO水溶液，粗酶液中要添加HO至HO的终浓度为15-40mM。 6.根据权利要求1所述的利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，其特征在于：步骤（2）所述的将粗酶液与玉米DDGS混合，每千克DDGS添加1.5-2.0L粗酶液。 7.根据权利要求1所述的利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，其特征在于：步骤（2）所述的反应是在68-70℃下反应6-9h，所述的烘干是在45-50℃下烘干。

技术领域

本发明涉及一种生产饲料的方法，具体涉及一种利用重组过氧化物酶 A4-Prx脱毒玉米酒糟中ZEA毒素生产饲料的方法。

背景技术

饲料和食品霉变是全世界普遍存在的问题，据联合国粮农组织（FAO）2002 年资料，全世界每年约有25%的农作物粮食被霉菌毒素污染，而我国平均每年由 于霉变所引起的饲料损失占总产量的10%以上，最主要的霉变来源于镰刀菌产生 的一种雌激素类真菌毒素——玉米赤霉烯酮（ZEA）。

ZEA性质稳定难降解，玉米及其副产品极易受ZEA污染。王金荣等对玉米 DDGS（酒糟蛋白饲料）多个样品调查结果显示，ZEA的阳性检出率均为100%， ZEA含量范围为4.79~1219.90μg/kg，超出国家标准（玉米中ZEA含量≤60μg/kg） 5～20倍以上，其对DDGS为饲料的禽畜危害深远（王金荣，马鹏，黄亚宽，等. 2010年上半年DDGS常规养分含量差异及霉菌毒素污染状况调查[J].饲料工业, 2011,32(17):61-64.）。

生物转化脱毒ZEA技术能避免物理和化学方法的去毒效果有限、营养物质 损失大、成本高和有害物质残留等缺点，已成为研究热点和主要趋势。日本 Takahashi-Ando等人对粉红粘帚霉（Clonostachys rosea）的研究较为全面，分离 出的内酯水解酶zhd101可破坏ZEA结构，使其转化为雌激素毒性较弱的化合物， 且ZEA的降解率在80%~90%之间（Kimara M,Naoko T,Nishiu-chi T.Molecular Biology and Biotechnology for Reduction of Fusarium Mycotoxin Contamination. Pesticide Biochemistry and Physiology,2006,86(3):117-123.）。大肠杆菌和酿酒酵 母表达的重组zhd101表现出了内酯水解酶的能力，对ZEA的降解率可达75%，具 有zhd101的转基因玉米也具备降解ZEA的能力（Tomoko I,Naoko T,Noriyuki O, et al.Reduced contamination by the fusarium mycotoxin zearalenone in maize kernels through genetic modification with a detoxification gene.Applied and Environmental Microbiology,2007,73(5):1622-1629.）。

此外，奥地利Molnar从白蚁后肠中分离出了一种新酵母菌—毛孢子菌属 Trichosporon mycotoxinivorans，它的培养物能将ZEA降解为二氧化碳和其它弱紫 外吸收的代谢物，从而降低其毒性（Molnar O,Schatzmayr G,Fuchs E，et al. Trichosporon mycotoxinivorans sp.nov.,a new yeast species useful in biological detoxification of various mycotoxins.Systematic and Applied Microbiology,2004, 27:661-671.）。

Abdullah从玉米地里分离的假单胞菌ZEA-1可利用ZEA为唯一碳源，并且在 12h内可将ZEA减少一半，编码此ZEA降解酶的基因在大肠杆菌中也获得了活性 表达（Abdulla D.Altalhi,Bahig El-Deeb.Localization of zearalenone detoxification gene(s)in pZEA-1 plasmid of Pseudomonas putida ZEA-1 and expressed in Escherichia coli.J Hazard Mater,2009,161:1166-1172.）。

中国发明专利CN99101577.0公开了一种菜籽饼发酵脱毒新方法，将菜籽饼 同发酵剂（淀粉类副产品或三七糠或玉米粉或麸皮等）按一定比例搅拌均匀， 在常温20℃以上，置于发酵池（防漏防渗）内加水，水面溢出料面5厘米左右， 发酵脱毒，从而得到优质饲料。

本课题组成员从Acinetobacter sp.SM04培养物上清液中分离到一种有降解 ZEA功能的过氧化物酶，克隆了其基因并在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中获得 了活性表达（Yu Yuanshan,Wu Hui,Tang Yuqian,et al.Cloning,Expression of a peroxiredoxin gene from Acinetobacter sp.SM04 and characterization of its  recombinant protein for zearalenone detoxifcation[J].Microbiol Res,2012,167(3): 121-126.）。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种利用重组过 氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，该方法能去除玉米DDGS中高 达98%的ZEA毒素。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，包括如下 步骤：

（1）制备重组过氧化物酶液A4-Prx：将重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4-Prx 接种于LB培养基中，摇床培养至其OD600值大于0.5，添加IPTG继续诱导培养 4-5h，然后离心收集细胞后洗涤、重悬，超声波破碎细胞后，离心收集上清液即 为粗酶液；

（2）饲料的制备：将步骤（1）的粗酶液与玉米酒糟蛋白饲料（即玉米DDGS） 混合，反应并烘干后得到安全的、无毒的饲料，DDGS中ZEA的降解率达98%以 上；

步骤（1）所述的LB培养基中含有50μg/mL的氨苄青霉素；

步骤（1）所述的添加IPTG优选添加至IPTG的终浓度为0.5mM；

步骤（1）所述的粗酶液中的过氧化物酶酶活大于300U/mL；

步骤（2）中，将粗酶液与玉米DDGS混合之前，每0.1kg玉米DDGS要添加 1.5L Na2CO3水溶液，粗酶液中要添加H2O2至H2O2的终浓度为15-40mM；

步骤（2）所述的将粗酶液与玉米DDGS混合，每千克DDGS添加1.5-2.0L粗 酶液；

步骤（2）所述的反应是在68-70℃下反应6-9h，所述的烘干是在45-50℃下 烘干。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

采用本发明的方法，可降解DDGS中98%以上的ZEA毒素，使玉米酒糟或 其他有毒饲料成为安全的饲料，实现了工业残渣的高值化利用。

附图说明

图1是利用重组过氧化物酶A4-Prx处理玉米酒糟DDGS中ZEA的液相检 测图；A-过氧化物酶A4-Prx酶液处理DDGS样品0h后ZEA的液相检测图，B- 过氧化物酶A4-Prx酶液处理DDGS样品9h后ZEA的液相检测图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式 不限于此。

实施例1

一种利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，包括如下 步骤：

（1）制备重组过氧化物酶液A4-Prx：

1.用LB固体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L， 琼脂20g/L，pH 7.0，50μg/mL氨苄青霉素）活化重组大肠杆菌BL21/pET31b /A4-Prx，放置28℃培养箱培养1天。

2.从活化LB固体培养基上挑取重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4-Prx的单菌 落，接种于LB液体种子培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L， pH 7.0，50μg/mL氨苄青霉素）中，28℃、220r/min振摇培养过夜，得到种液。

3.取种液10mL，接入200mL的LB液体富集培养基中（胰蛋白胨10g/L， 酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，50μg/mL氨苄青霉素） 中，28℃、250r/min振摇培养，每隔1h取样检测其OD600；6h后培养液OD600值达到0.54，添加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续于28℃、250r/min摇床 培养4h。

4.将培养液在10,000×g离心5min，弃上清，加入200mL 50mM的Tris-HCl 缓冲液（pH8.0）洗涤1次。添加200mL 50mM的Tris-HCl缓冲液（pH8.0）， 漩涡震荡使菌体悬浮均匀，用超声波细胞破碎仪破碎细胞(4℃，200W，15min)， 10,000×g离心5min，收集上清液，即为粗酶液。

5.粗酶液中过氧化物酶的酶活达316U/mL。

过氧化物酶活测定方法如下：

取920μL的0.1mol/L Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液、20μL的0.2mol/L 4-氨基 安替吡啉水溶液、20μL的0.3mol/L苯酚溶液（用甲醇溶解）、1mL粗酶液，混 合均匀。放置于70℃的恒温水浴锅中保持2min后，添加20μL的1mol/L的双 氧水启动反应。反应5min后，用紫外分光光度计测A500值。用1mL LB液体富 集培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0， 50μg/mL氨苄青霉素）作空白对照。粗酶液中过氧化物酶酶活的计算公式为：I （U/mL）=60×每分钟A500的升高值/0.01（1个过氧化物酶活性单位为：实验规 定的酶活力条件下，每小时吸光值A500升高0.01个单位所需的酶量）。

（2）饲料制备：

1.添加1.5L 2%的Na2CO3水溶液(v/m)于0.1kg玉米酒糟DDGS中，采用 滚筒式搅拌器混合均匀。

2.往150mL粗酶液中添加30%H2O2（g/mL）水溶液0.17mL，使H2O2终 浓度达到15mM，再添加到用处理Na2CO3后的DDGS中，30r/min拌料均匀， 在68℃温育5h，45℃烘干后，取样检测DDGS中的ZEA残留，其降解率达到 98.6%，即得到安全的、无毒的饲料。

检测ZEA降解率的方法如下：

取2g粗酶液处理后DDGS，加入2mL 0.1M Tris-HCl(pH 9.0)及15mL乙 腈，常温旋涡振摇10min，滤纸过滤。用PuriToxSR TC-M160真菌毒素多功能 净化柱过滤5mL滤液，收集流出液体3mL于60℃下N2蒸发仪蒸干后用500μL 流动相溶解，溶解液用于高效液相色谱(HPLC)分析检测ZEA的残留量。

高效液相色谱（HPLC）检测ZEA的条件：色谱柱采用Waters XTerraR MS C18 柱(4.6×150mm，5μm)。流动相为乙腈∶水∶甲醇=46∶46∶8。柱温30℃，流 量为1mL/min。结果采用荧光检测器，激发波长274nm，发射波长450nm。设 置对照组中，使用去离子水代替酶液。结果以相对降解率表示。计算公式如下：

实施例2

一种利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，包括如下 步骤：

（1）制备重组过氧化物酶液A4-Prx：

1.用LB固体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L， 琼脂20g/L，pH 7.0，50μg/mL氨苄青霉素）活化重组大肠杆菌BL21/pET31b /A4-Prx，放置32℃培养箱培养1天。

2.从活化LB固体培养基上挑取重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4-Prx的单菌 落，接种于LB液体种子培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L， pH 7.0，50μg/mL氨苄青霉素）中，32℃、230r/min振摇培养过夜，得到种液。

3.取种液16mL，接入200mL的LB液体富集培养基中（胰蛋白胨10g/L， 酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，50μg/mL氨苄青霉素） 中，32℃、250r/min振摇培养，每隔1h取样检测其OD600；6h后培养液OD600值达到0.61，添加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续于32℃、250r/min摇床 培养5h。

4.将培养液在10,000×g离心5min，弃上清，加入200mL 50mM的Tris-HCl 缓冲液（pH8.5）洗涤1次。添加200mL 50mM的Tris-HCl缓冲液（pH8.5）， 漩涡震荡使菌体悬浮均匀，用超声波细胞破碎仪破碎细胞(4℃，200W，15min)， 10,000×g离心5min，收集上清液，即为粗酶液。

5.检测粗酶液中过氧化物酶的酶活达322U/mL。过氧化物酶活测定方法与 实施例1相同。

（2）饲料制备：

1.添加1.5L 2%Na2CO3(v/m)于0.1kg玉米酒糟DDGS中，采用滚筒式搅 拌器混合均匀。

2.往150mL粗酶液中添加30%H2O2（g/mL）水溶液0.51mL，使H2O2终 浓度达到30mM，再添加到用Na2CO3处理后的DDGS中，30r/min拌料均匀， 在69℃温育7.5h，48℃烘干后，取样检测DDGS中的ZEA，其降解率达到99.1%， 得到安全的、无毒的饲料。

检测ZEA降解率方法与实施例1中相同。

实施例3

一种利用重组过氧化物酶A4-Prx脱毒玉米酒糟生产饲料的方法，包括如下 步骤：

（1）制备重组过氧化物酶液A4-Prx：

1.用LB固体培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L， 琼脂20g/L，pH 7.0，50μg/mL氨苄青霉素）活化重组大肠杆菌BL21/pET31b /A4-Prx，放置37℃培养箱培养1天。

2.从活化LB固体培养基上挑取重组大肠杆菌BL21/pET31b/A4-Prx的单菌 落，接种于LB液体种子培养基（胰蛋白胨10g/L，酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L， pH 7.0，50μg/mL氨苄青霉素）中，37℃、250r/min振摇培养过夜，得到种液。

3.取种液10mL，接入200mL的LB液体富集培养基中（胰蛋白胨10g/L， 酵母抽提物5g/L，NaCl 10g/L，琼脂20g/L，pH 7.0，50μg/mL氨苄青霉素） 中，37℃、250r/min振摇培养，每隔1h取样检测其OD600；6h后培养液OD600值达到0.58，添加IPTG，使其终浓度为0.5mM，继续于37℃、250r/min摇床 培养4h。

4.将培养液在10,000×g离心5min，弃上清，加入200mL 50mM的Tris-HCl 缓冲液（pH9.0）洗涤1次。添加200mL 50mM的Tris-HCl缓冲液（pH9.0）， 漩涡震荡使菌体悬浮均匀，用超声波细胞破碎仪破碎细胞(4℃，200W，15min)， 10,000×g离心5min，收集上清液。

5.检测粗酶液中过氧化物酶的酶活达318U/mL。过氧化物酶活测定方法与 实施例1相同。

（2）饲料制备：

1.添加1.5L 2%Na2CO3(v/m)于0.1kg玉米酒糟DDGS中，采用滚筒式搅 拌器混合均匀。

2.往150mL粗酶液中添加30%H2O2（g/mL）水溶液0.68mL，使H2O2终 浓度达到40mM，再添加到用Na2CO3处理后的DDGS中，30r/min拌料均匀， 在70℃温育9h，50℃烘干后，取样检测DDGS中的ZEA，结果如图1所示，其 降解率达到98.8%，得到安全的、无毒的饲料。

检测ZEA降解率的方法与实施例1中相同。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施 例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替 代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

本文标签： 酒糟饲料玉米方法化物酶