用聚乳酸为载体制备缓释生物农药的方法及所得产物

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本发明提供一种用聚乳酸为载体制备缓释生物农药的方法，包括步骤：1)将餐厨垃圾进行初步分选，得到垃圾原料；2)调节垃圾原料的含水率至75-90％，得垃圾浆；3)加入苏云金杆菌菌种，在25-35℃的条件下发酵2-4天；4)发酵液离心分离，用高速离心法提取，冷冻干燥，得到伴孢晶体粉末；5)伴孢晶体粉末与聚乳酸按质量比1:1～10配比，注塑成型。采用本发明的方法获得的BT生物农药，具有生产成本低廉，工艺简单等优点，同时利用聚乳酸为载体制备的缓释农药，能够解决生物农药使用过程中的不足，如：稳定性差和残效期短。本发明中所用的餐厨垃圾来源广泛，原料易得，其中含有丰富的碳源，是适合BT菌生长的发酵基底。

1.一种用聚乳酸为载体制备缓释生物农药的方法，包括步骤：1)将餐厨垃圾进行初步分选，将其中的固体绞碎至直径1-3mm，得到垃圾原料；2)调节垃圾原料的含水率至75-90％，混合均匀，获得垃圾浆；3)垃圾浆经过灭菌，然后按照1-4g(菌体湿重)/L(发酵培养基)向垃圾浆中加入苏云金杆菌菌种，在25-35℃的条件下发酵2-4天；4)步骤3)所得发酵液在100-500rpm下离心3-10min，上清液用纱布过滤，所得滤液在4000-8000rpm下离心5-10min，分离过滤液与伴孢晶体，用高速离心法提取伴孢晶体1-3次，然后冷冻干燥20-30h，得到伴孢晶体粉末；5)步骤4)制备的伴孢晶体粉末与分子量5000-50万的聚乳酸按质量比1:1～10配比，混合均匀后注塑成型。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，通过对餐厨垃圾的初步分选，去除其中不易发酵的杂物，所述杂物包括餐具、塑料制品和纸张。 3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中，调节垃圾原料的pH值为6.5-7.5，pH值用碱调节，所述碱为氢氧化钠、NaCO、氨水中的一种或多种。 4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，垃圾浆121℃灭菌20min，待冷却后加入苏云金杆菌菌种。 5.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，按照2-3g(菌体湿重)/L(发酵培养基)向垃圾浆中加入苏云金杆菌菌种，在30℃的条件下发酵2-3天。 6.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，伴孢晶体粉末与分子量1万-5万的聚乳酸按质量比1:1-10配比，混合均匀后注塑成型。 7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，伴孢晶体粉末与分子量1万-5万的聚乳酸按质量比1:5-6配比。 8.根据权利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述步骤5)中，伴孢晶体粉末与聚乳酸混合注入注塑机，制成直径为2mm的圆柱体。 9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，注塑的温度范围为100-180℃，合模压力为1000～1500KG。 10.权利要求1-9任一所述的方法制备得到的缓释生物农药。

技术领域

本发明属于生物农药领域，具体涉及一种以聚合物为载体生产缓 释生物农药的方法。

背景技术

我国已成为世界第一农药生产和使用大国，单位面积平均化学农 药的用量比世界平均用量高2.5～5.0倍，每年遭受残留农药污染的作 物面积达8000万hm2，其中污染严重的比率达40％，而生物农药因其 无公害、无污染、无残留，在无公害农业生产上具有广阔的发展前景。

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，BT)是世界上用途最 广、产量最大的微生物农药，目前，BT生物农药主要以各种工农业 产品或农副产品液态发酵得到，其价格约占总生产成本的35％～59％， 严重限制了生物农药的广泛应用。餐厨垃圾中总碳含量为50％-60％， 易为苏云金芽孢杆菌同化利用的还原糖、淀粉等在碳源中所占比例较 高，是一种良好的BT菌培养基质。顾采琴等(顾采琴等,菠萝皮渣半 固态法酿醋工艺,食品科学,2010,16,56-60.)采用半固态发酵生产食 醋，发现半固态发酵较固态发酵传质速度快，发酵时间明显缩短，发 酵效率明显提高，而利用餐厨垃圾半固态进行生物农药发酵的研究未 见报道。

虽然苏云金芽孢杆菌具有高效异性的杀虫活性和对人畜及非目 标昆虫的安全性，同时对环境没有不利影响，但由于BT杀虫剂的杀 虫活性稳定性差以及残效期短，从而限制了BT生物农药更广泛的应 用，鉴于此，人们采用微囊化及基因工程等技术手段来延长苏云金芽 孢杆菌的田间残效期，但仍有工艺复杂，成本高的不足。聚乳酸具有 良好的生物相容性以及生物可降解性，其最终降解产物乳酸，具有无 毒无副作用的特点，近年来人们对低廉乳酸的来源研究颇多，如利用 餐厨垃圾，蜜糖废水，农业废水等生产乳酸。本专利利用聚乳酸为载 体制备缓释生物农药，具有操作简单，成本低廉的优势，而且可以解 决生物农药控制虫害的时效性和易被冲刷、流失、分解等问题，为生 物农药在农业上广泛应用奠定基础。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明的目的是提出一种用聚乳酸为 载体制备缓释生物农药的方法。

本发明的另一目的是提出用所述方法制备得到的缓释生物农药。

实现本发明上述目的的具体技术方案为：

一种用聚乳酸为载体制备缓释生物农药的方法，包括步骤：

1)将餐厨垃圾进行初步分选，将其中的固体绞碎至直径1-3mm， 得到垃圾原料；

2)调节垃圾原料的含水率至75-90％，混合均匀，获得垃圾浆；

3)垃圾浆经过灭菌，然后按照1-4g(菌体湿重)/L(发酵培养基)向 垃圾浆中加入预先培养的苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis，BT)菌 种，在25-35℃的条件下发酵2-4天；

4)步骤3)所得发酵液在100-500rpm下离心3-10min，上清液 用纱布过滤，所得滤液在4000-8000rpm下离心5-10min，分离过滤液 与伴孢晶体，用高速离心法提取伴孢晶体1-3次，然后冷冻干燥 20-30h，得到伴孢晶体粉末；

5)步骤4)制备的伴孢晶体粉末与分子量5000-50万的聚乳酸按 质量比1:1～10配比，混合均匀后注塑成型。

餐厨垃圾是家庭、学校、食堂及餐饮行业等产生的食物加工下脚 料(厨余)和食用残余(泔脚)。其成分包括油、水、果皮、蔬菜、米面、 鱼、肉、骨头以及废餐具、塑料、纸巾等多种物质。

其中，所述步骤1)中，通过对餐厨垃圾的初步分选，去除其中 不易发酵的杂物，所述杂物包括餐具、塑料制品和纸张。

一般垃圾原料的含水率在75-90％之间，将餐厨垃圾干物质绞碎 后再混入液态部分，不需额外加水或加少量水，不需要干燥。

优选地，所述步骤2)中，调节垃圾原料的pH值为6.5-7.5，pH 值用碱调节，所述碱为氢氧化钠、Na2CO3、氨水中的一种或多种(餐 厨垃圾初始pH为5.8左右)。通常，用质量百分比10-30％的氢氧化 钠溶液、Na2CO3或氨水。

其中，所述步骤3)中，垃圾浆121℃灭菌20min，待冷却后加 入苏云金杆菌菌种。

优选地，所述步骤3)中，按照2-3g(菌体湿重)/L(发酵培养基) 向垃圾浆中加入预先培养的BT(苏云金杆菌)菌种，在30℃的条件 下发酵2-3天；

菌体的湿重是将培养物离心后将湿菌体进行称重得到的。

进一步地，所述5)步骤中，伴孢晶体粉末与分子量1万-5万的 聚乳酸按质量比1:1～10配比，混合均匀后注塑成型。

进一步优选地，伴孢晶体粉末与分子量1万-5万的聚乳酸按质量 比1:5-6配比。实验结果表明，当伴孢晶体粉末与聚乳酸添加比为1:5-6 时，在水的侵蚀作用下，伴孢晶体粉末的溶出率均＞85％，伴孢晶体 粉末溶出效率高。

其中，所述步骤5)中，伴孢晶体粉末与聚乳酸混合注入注塑机， 制成直径为2mm的圆柱体。

具体地，注塑的温度范围为：100-180℃，合模压力为 1000～1500KG。

本发明所述的方法制备得到的缓释生物农药。

本发明的有益效果在于：

采用本发明的方法获得的BT生物农药，相对于传统方法，具有 生产成本低廉，工艺简单等优点，同时利用聚乳酸为载体制备的缓释 农药，能够解决生物农药使用过程中的不足，如：稳定性差和残效期 短。本发明中所用的餐厨垃圾来源广泛，原料易得，餐厨垃圾作为发 酵底物，其中含有丰富的碳源，是适合BT菌生长的发酵基底。

附图说明

图1为发酵时间和伴孢晶体含量的关系图。

具体实施方式

现以以下最佳实施例来说明本发明，但不用来限制本发明的范 围。

实施例中使用的BT菌为苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种 Thuringiensis subsp.Kurstaki，菌株保藏编号CICC 21707。

实施例1：

1)将餐厨垃圾进行初步分选，去除餐巾纸、塑料包装、一次性 餐具等，绞碎其中的固体至直径1-3mm。餐厨垃圾的含水率在75-90％ 之间，把固体滤出来的粉碎，再和液体混合即得垃圾浆如果含水率过 高，滤出来的固体粉碎后可不全加入液体；如果含水率低，可适当加 入自来水。调节垃圾原料的含水率至80％，用氢氧化钠10wt％溶液调 节pH值至7.0，混合均匀，获得垃圾浆；

2)垃圾浆121℃灭菌20min，冷却后，按照1g/L接入BT菌种， 30℃发酵3天；

3)上一步所得发酵液在-500rpm下离心5min，上清液用纱布过 滤，所得滤液在5000rpm下离心10min，分离过滤液与伴孢晶体，用 高速离心法(10000rpm转速)对伴孢晶体进行2次提纯后，放入冷 冻干燥机中冷冻干燥24h，得到淡黄色的伴孢晶体粉末；

4)按每份5g称取，选取伴孢晶体粉末与分子量1万的聚乳酸按 质量比1:1充分混合后，缓慢加入低压注塑机，制成直径为2mm的 圆柱体，注塑温度130℃，上下合模压力为1200KG。在此步骤中， 还进行平行试验：伴孢晶体粉末与分子量3万的聚乳酸、分子量5万 的聚乳酸按质量比1:1充分混合后同样进行压制。

本试验以同样的方法，调整步骤2)中BT菌接种量分别为2g/L， 3g/L，4g/L，结果同样的发酵时间，测所得伴孢晶体产量，结果见图 1。其中，接种量为2g/L，3g/L的伴孢晶体产量分别为1426μg/ml， 1500μg/ml(见图1)，结果优于1g/L，4g/L接种量的发酵结果。考虑 到接种量为2g/L和3g/L的产量相差并不大，进一步考虑成本因素， 优选按接种量2g/L进行后续试验。接种量为2g/L，发酵后孢子数为 2.15×1011，经过步骤3)分离所得苏云杆菌芽孢杆菌伴孢晶体蛋白纯 度为91.75％，毒力效价为57250IU/mg。

实施例2

1)垃圾浆和实施例1同样获取方法，经灭菌冷却后，按照2g/L 接入BT菌种，30℃发酵2-3天；

2)上一步所得发酵液在500rpm下离心5min，上清液用纱布过 滤，所得滤液在8000rpm下离心5min，分离过滤液与伴孢晶体，用 高速离心法对伴孢晶体进行2次提纯后，放入冷冻干燥机中冷冻干燥 24h，得到淡黄色的伴孢晶体粉末；

3)按每份5g称取，选取伴孢晶体粉末与分子量1万的聚乳酸按 质量比1:3充分混合后，缓慢加入低压注塑机，在温度120℃、上下 合模压力1200KG条件下制成直径为2mm的圆柱体。在此步骤中， 还进行平行试验：伴孢晶体粉末与分子量3万的聚乳酸、分子量5万 的聚乳酸按质量比1:3充分混合后同样进行压制。

实施例3

1)垃圾浆如实施例1方法制备，灭菌冷却后，按照2g/L接入 BT菌种，30℃发酵2-3天；

2)上一步所得发酵液在500rpm下离心5min，上清液用纱布过 滤，所得滤液在6000rpm下离心7min，分离过滤液与伴孢晶体，用 高速离心法对伴孢晶体进行2次提纯后，放入冷冻干燥机中冷冻干燥 24h，得到淡黄色的伴孢晶体粉末；

3)按每份5g称取，选取伴孢晶体粉末与分子量1万的聚乳酸按 质量比1:5充分混合后，缓慢加入注塑机，压塑条件同实施例1，制 成直径为2mm的圆柱体。在此步骤中，还进行平行试验：伴孢晶体 粉末与分子量3万的聚乳酸、分子量5万的聚乳酸按质量比1:5充分 混合后同样进行压制。

实施例4

1)垃圾浆灭菌冷却后，按照2g/L接入BT菌种，30℃发酵2-3 天；

2)上一步所得发酵液在400rpm下离心5min，上清液用纱布过 滤，所得滤液在4000rpm下离心10min，分离过滤液与伴孢晶体，用 高速离心法对伴孢晶体进行2次提纯后，放入冷冻干燥机中冷冻干燥 24h，得到淡黄色的伴孢晶体粉末；

3)按每份5g称取，选取伴孢晶体粉末与分子量1万的聚乳酸按 质量比1:10充分混合后，缓慢加入注塑机，制成直径为2mm的圆柱 体。压塑条件同实施例1。在此步骤中，还进行平行试验：伴孢晶 体粉末与分子量3万的聚乳酸、分子量5万的聚乳酸按质量比1:10 充分混合后同样进行压制。

各实施例所得缓释农药产品，均取5g分别加入1L的蒸馏水，加 盖密封。所有实施例(注塑条件及产品形状相同)的平均释放量及pH 值见下表。

表1：聚乳酸缓释剂释放速率

表中质量比是指晶体蛋白:聚乳酸的质量比。

实验数据表明，聚乳酸能起到良好的缓释作用，在释放周期内稳 定地释放生物农药，由于伴孢晶体毒性蛋白溶解后呈碱性，聚乳酸降 解生成乳酸，因此聚乳酸添加量越多，pH值就越低，此举亦可用于 解决土壤碱化问题。缓释试验中，伴孢晶体粉末与聚乳酸添加比为 1:5的产品在水的侵蚀作用下，伴孢晶体粉末的溶出率均＞85％，伴 孢晶体粉末溶出效率更高。

实验例：毒性效力评价

选取不同分子量聚乳酸与伴孢晶体粉末按质量1:1配比制成缓释 生物农药进行毒力效价测定，参照GB/T19567.2-2004标准，以 CS-1995，H3ab(效价20000IU/mg)为标准品，并以三龄棉铃虫幼 虫为试虫，48h检查试虫的死亡情况，进而计算得出毒力效价，见下 表。

表2 毒力效价

聚乳酸分子量 毒力效价/(IU/mg) 1万 6230.12 3万 6169.34 5万 6076.73

上表数据表明，不同分子量的聚乳酸为载体制备缓释生物农药的 毒性效价相差不大，均在6000IU/mg以上，满足GB/T19567.2-2004 标准中苏云金芽孢杆菌悬浮剂毒力效价要求。

以上的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对 本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域 普通工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变型和改进，均应 落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。

本文标签： 产物所得方法生物农药聚乳酸