一种含有溶菌酶的饲料添加剂、药物组合物及其用途

admin管理员组

文章数量:866648

本发明涉及了一种含有微生物溶菌酶的饲料添加剂、药物及其用途，通过把溶菌酶与复合油脂、中药组合物结合使用，并且控制溶菌酶的用量，对饲料中的添加量作相应的调整，通过三者的协同作用，利用溶菌酶具有的良好的抗菌杀菌效果，复合油脂、中药组合物对于机体的免疫调节、自由基调节和辅助作用，从内而外调整机体，能够有效对抗炎症、感染、增强自身抵抗力、抗病性，对抗生素已产生耐药性的菌株也有很强的杀灭作用，保证动物的肠道的健康，防治动物下痢，提高动物生产性能。使用本方法疗效好、安全性高，成本低廉，无耐药性、无药物残留、无毒副作用、是绿色环保的活性物质。

1.一种饲料添加剂，所述添加剂中含有溶菌酶，浓度为25-300ppm，其特征在于，添加剂中还含有添加剂总量1-10％复合油脂和1-5％中药组合物。 2.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其特征在于，所述复合油脂为DHA和亚麻油，DHA与亚麻油的比例为1：2～1：20。 3.根据权利要求1或2所述的饲料添加剂，其特征在于，所述中药组合物采用白术、葛根、连翘、虎掌草、山楂和苦参为原料制成，所述中药组合物的重量份为白术10-30份、葛根10-18份、连翘5-15份、虎掌草1-8、山楂1-8份、苦参1-8份。 4.根据权利要求1至3之一所述的饲料添加剂，其特征在于，所述动物为畜禽，优选为家畜，更优选为猪。 5.根据权利要求3所述的饲料添加剂，其特征在于，优选含有50ppm溶菌酶，3％复合油脂和2％中药组合物；复合油脂中DHA与亚麻油的比例为1：10；白术25份、葛根14份、连翘11份、虎掌草2、山楂3份、苦参2份。 6.权利要求1至5中任一项所述的饲料添加剂在制备预防或治疗动物感染的饲料中的用途。 7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述动物感染为猪高热病。 8.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述动物感染为猪痢疾。 9.根据权利要求6至8之一所述的用途，其特征在于，所述饲料添加剂在饲料中的添加量为0.5-20％。 10.一种预防或治疗猪痢疾、猪高热病的药物组合物，由原料药和药学上可接受的载体组成，其特征在于，以组合物总量计，原料药为50ppm的溶菌酶、3％的复合油脂和2％的中药组合物；所述复合油脂为DHA和亚麻油，DHA与亚麻油的比例为1：10；所述中药组合物原料为白术25份、葛根14份、连翘11份、虎掌草2、山楂3份、苦参2份。

技术领域

本发明涉及一种畜禽饲料添加剂和药物组合物，尤其涉及一种含有溶菌酶的饲料添加剂 及其用途。

背景技术

仔猪腹泻是养猪生产中的一种典型的多因素疾病，据统计，仔猪腹泻的发病率为35％， 其间接损失又表现在治愈仔猪生长发育迟缓，饲料转化率低，严重威胁养猪业的发展。自2006 年5月以来，在全国各地先后爆发流行猪高热病，引起大批猪只发病死亡，造成重大的经济 损失。直至目前，高热病仍在全国22个省份的猪群中发生流行，危害猪只的健康生长，威胁 着养猪业的发展。抗生素在养殖中的使用所带来的不良后果大家都已充分认识。许多专家都 认为在全国很多地区广泛流行的“猪高热病”的一个重要原因是猪的免疫力低下，抗病力低， 而长期地、大剂量地使用抗生素是导致猪免疫力低下的一个重要原因。

现有技术中公开了溶菌酶用于治疗家畜感染，CN101612393A公开了一种微生物溶菌酶在 预防猪疾病的药物及添加剂中的应用方法，通过溶菌酶或与氟本尼考结合使用，达到治疗效 果；CN101611765A通过添加较高剂量的溶菌酶达到预防、治疗仔猪腹泻的效果。但是，之 前的研究对于溶菌酶的运用手段有限、溶菌酶使用量高，成本较高，并且氟本尼考等抗生素 的使用对于机体的恢复有影响。研究还发现，动物体内的益生菌对溶菌酶有一定的耐受性， 在25mg／kg浓度下，溶菌酶不会影响嗜热乳杆菌和链球菌的生长，但如果超过益生菌的耐受 浓度范围，溶茵酶对益生菌就会有一定的抑制作用。由此，如何改进现有技术的溶菌酶药效 是需要解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种含有溶菌酶的饲料添加剂、药物组合物及其用途，利用该添 加剂能有效降低溶菌酶的使用量，减少不良作用，在不使用抗生素的前提下得到更好的抗菌 效果，更加安全、有效地治疗猪的感染，同时达到促生长、提高猪免疫力的作用，感染复发 率低。

为了实现上述目的本发明采用的技术方案如下：

本发明所提供的一种动物饲料添加剂，所述添加剂中含有溶菌酶，浓度为25-300ppm，添 加剂中还含有添加剂总量1-10％复合油脂和1-5％中药组合物。

所述复合油脂为DHA和亚麻油，DHA与亚麻油的比例为1：2～1：20。

所述中药组合物采用白术、葛根、连翘、虎掌草、山楂和苦参为原料制成，所述中药组 合物的重量份为白术10-30份、葛根10-18份、连翘5-15份、虎掌草1-8、山楂1-8份、苦参 1-8份。

称取所需重量份的白术、葛根、连翘、虎掌草、山楂和苦参，混合后超微粉碎，过100-200 目筛，按所需比例添加到饲料添加剂或药物中。

所述动物为畜禽，优选为家畜，更优选为猪、仔猪。

为了达到较好的效果，同时降低成本，优选的动物饲料添加剂含有50ppm溶菌酶，3％复 合油脂和2％中药组合物；复合油脂为DHA和亚麻油，DHA与亚麻油的比例为1：10；白术 10-30份、葛根10-18份、连翘5-15份、虎掌草1-8、山楂1-8份、苦参1-8份。

本申请还提供了一种预防或治疗猪痢疾、猪高热病的药物组合物，由原料药和药学上可 接受的载体组成，原料药为50ppm的溶菌酶、3％的复合油脂和2％的中药组合物；所述复合 油脂为DHA和亚麻油，DHA与亚麻油的比例为1：10；所述中药组合物原料为白术25份、 葛根14份、连翘11份、虎掌草2、山楂3份、苦参2份。

溶菌酶是能溶解细菌细胞壁的一种酶，是一类物质的的总称。作为非特异性免疫的重要 成员，溶菌酶在防御外源微生物入侵方面发挥重要的作用，其在动物的免疫细胞和巨噬细胞 中含量比较高。溶菌酶对革兰氏阳性菌、好气性孢子形成的菌、枯草杆菌、耐辐射微球菌均 具有良好的分解作用，对大肠杆菌、沙门氏菌和副血性弧菌等革兰氏阴性菌也具有溶解作用。 基于此，本发明将溶菌酶添加于饲料添加剂中，来预防和治疗猪的细菌性疾病。

DHA是常用的神经系统细胞生长因子，然而，本申请出乎意料地发现，DHA对于溶菌 酶缓解炎症、提高的抗力方面具有增效作用，可能是由于DHA会抑制发炎前驱动物质的形 成，从而发挥相关作用；亚麻油富含α-亚麻酸、DHA和EPA，添加亚麻油能够降低DHA的 用量，降低成本；另外，DHA、亚麻油能够提供机体所需多不饱和脂肪酸，比如Omega3脂 肪酸，能够降低机体自由基水平，达到提高机体抵抗力的作用。

中药白术、葛根、连翘、虎掌草、山楂和苦参具有清热解毒、健脾和胃、活血通络、增 强体质的作用，不仅达到辅助治疗的目的，而且增强消化系统、循环系统功能，缓解愈后机 体损伤，增强畜类抗病力。

本发明提供了所述饲料添加剂在用于制备预防或治疗动物感染的饲料中的用途；提供了 所述药物组合物在用于制备预防或治疗动物感染的药物中的用途。

所述动物感染为猪高热病或猪痢疾。

本发明所述的饲料添加剂，以0.5～20％的比例添加于饲料中，用于饲料常规饲喂；也可直 接口服。

本发明的有益效果如下：

1、本发明有效治疗猪的细菌性疾病、猪痢疾及高热病，缓解症状，显著提高猪的免疫力， 减缓应激反应，改善维护胃肠道菌群平衡。疗效好、安全性高，成本低廉，无耐药性、无药 物残留、无毒副作用、是绿色环保的活性物质。

2、通过溶菌酶、复合油脂和中药组合物三者的协同作用，利用溶菌酶具有的良好抑菌杀 菌效果，复合油脂、中药组合物对于机体的免疫调节、自由基调节、提高抵抗力和辅助消炎 的效果，从内而外调整机体，能够有效对抗炎症、感染、增强自身抵抗力、抗病性，对抗生 素已产生耐药性的菌株也有很强的杀灭作用，保证动物的肠道的健康，防治动物下痢，提高 动物生产性能。

3、完善了溶菌酶的使用，通过与其他活性成分配伍使用，有效地降低了溶菌酶的用量， 并且达到更好的治疗效果。

4、采用积极的疗法，副作用低，在治疗的同时激发机体免疫水平，通过自身免疫力的提 高达到治疗和提高抗病性的效果，同时饲喂发病动物和易感动物，能够同时达到预防和治疗 效果。

5、溶菌酶是在食品工业中是优良的天然防腐剂，对革兰阳性菌、枯草杆菌、耐辐射微球 菌等均有强力溶壁作用。对大肠杆菌、普通变形菌和副溶血弧菌等革兰氏阴性菌等也有一定 的溶解作用，添加在饲料中不会破坏饲料中的营养成分，在饲料中添加溶菌酶可防止霉变， 延长饲料的贮存期，降低摄入霉变饲料的几率，从源头预防动物感染。

具体实施方式

实施例一：溶菌酶的抑菌试验

本申请所用的溶菌酶的要求为：通过药敏试验，在100ppm时应有明显的抑菌圈，即抑菌 圈的直径＞10mm。药敏试验方法如下：做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大 肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。

一、一般LB培养基的配制

1、液体培养基的配制

蛋白胨1g、NaCl1g、酵母提取物0.5g(建议选用国外公司产品)溶于100ml水中。

2、固体培养基的配制

在液体培养基的基础上每100ml中添加琼脂1.7g或琼脂粉2g。

二、灭菌

整个实验过程中所用的培养基、平板、枪头、棉签、生理盐水以及缓冲溶液均需要灭菌。

三、操作过程

1、将指示菌(大肠杆菌、沙门氏菌等等)从培养液(基)中接种于平板活化培养，待菌落长出 后在平板上挑选典型菌落接种于试管中的液体培养基中培养4-6小时后比浊。

2、用涂菌棒(或者灭菌棉签)将待检细菌混悬液涂抹于平皿培养基表面，要求涂布均匀致 密。

3、以无菌操作将灭菌的不锈钢小管(也可用玻璃管、瓷管)，放置在培养基上打孔，将孔 中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合(以防药液渗漏，影响 结果)。

4、将配制好的待测样品液80微升加入样孔中，样品加完后放入30-37℃的培养箱中培养 12-18小时后观察结果。

注意：试验的过程在无菌的条件下操作。

四、溶菌酶样品液的配制

1、粉状样品的配制：

取溶菌酶样品用灭菌好的生理盐水逐级稀释到浓度梯度为400ppm，300ppm，200ppm， 100ppm，50ppm，25ppm然后分别取80微升稀释好的溶液置于样品孔中。(注：在温度较低 的情况下，可能会出现稍微的不溶的情况，可加热至35-40℃即可溶解)

2、注意事项

1)配置好的样品液不要放在冷冻的条件下保存，也不能放在无菌操作台上被紫外线照射；

2)样品液在配制稀释过程中注意要逐级稀释。

为了确定溶菌酶在药物及添加剂中的加入量，我们进行了如下药敏实验：选择400ppm， 300ppm，200ppm，100ppm，50ppm，25ppm六个浓度进行试验，试验方法同上，以埃希氏大 肠杆菌为试验菌种，通过检测检测抑菌圈的大小检验试验结果，具体如表1。

表1抑菌试验结果

从表1可以看出，25-100ppm的溶菌酶抑菌效果不明显，随着溶菌酶浓度的增加，抑菌效 果显著增加，然而，超过300ppm后，抑菌效果增加不明显。

实施例2：仔猪痢疾试验

(1)预防效果试验设计

28日龄仔猪随机分成10组，每次摄入5g添加剂，每日4次。分别为对照组(不添加饲料 添加剂)；试验组1、试验组2、试验组3，试验组4，试验组5；对比组1、对比组2、对比组 3，对比组4；每组设三个重复组，试验期4周。预防腹泻、痢疾的选择体况相同的仔猪进行 攻毒试验，其预防效果见表2。

试验组1：添加剂中含有溶菌酶，浓度为25ppm，添加剂中还有添加剂总量3％复合油脂 和2％中药组合物；所述复合油脂为DHA和亚麻油，DHA与亚麻油的比例为1：10；中药组 合物为白术25份、葛根14份、连翘11份、虎掌草2、山楂3份、苦参2份。

试验组2：添加剂中含有溶菌酶，浓度为50ppm，其他同试验组1。

试验组3：添加剂中含有溶菌酶，浓度为100ppm，其他同试验组1。

试验组4：添加剂中含有溶菌酶，浓度为200ppm，其他同试验组1。

试验组5：添加剂中不含溶菌酶，其他同试验组1。

对比组1-4分别为CN101611765A具体实施方式中针对仔猪试验的试验1组-4组。

(2)治疗效果试验设计

出现痢疾的猪随机分成10组，每次摄入20g，每日四次。分别为对照组(不添加饲料添加 剂)；试验组1、试验组2、试验组3，试验组4；对比组a、对比组b、对比组c，对比组d； 每组设三个重复组，试验期1周，其治疗效果见表2。

对比组a：仔猪仅灌服溶菌酶制剂日平均0.5g。

对比组b：仔猪仅灌服溶菌酶酶制剂日平均1g。

对比组c：仔猪仅灌服溶菌酶酶制剂日平均2g。

对比组d：：仔猪仅灌服溶菌酶酶制剂日平均3g。

(3)观测指标与管理

观测各组耗料量、增重、腹泻头次数等，并作记录。同栋分栏饲养，饲喂颗粒饲料，分 餐饲喂，每天四次(时间分别为7：00、11：00、15：00、19：00)，按常规仔猪饲养管理。

表2预防和治疗腹泻情况

从表2可以看出，本申请使用了极低的溶菌酶用量(50ppm以上溶菌酶含量的饲料添加 剂，预防试验日摄入20g添加剂相当于摄入1mg溶菌酶，治疗试验日摄入80g添加剂相对于 摄入4mg溶菌酶)达到了显著的预防和治疗腹泻的效果，与同等溶菌酶浓度的对比组1-4相 比，平均腹泻率明显降低；与对比组a-d相比，使用更低剂量的溶菌酶，达到了等效的治愈 效果，平均腹泻率明显降低；不添加溶菌酶的试验组5具有一定的防治效果，但是防治效果 均低于添加溶菌酶的试验组，说明复合油脂和中药组合物的使用使得溶菌酶的作用增效，达 到了协同防治效果。

实施例3：仔猪高热病试验

在猪场高热病的发病初期，通过饲喂试验组1-4的饲料添加剂，通过饲喂含有溶菌酶的 饲料可以防止高热病的进一步恶化，高热病初期的疾病控制结果见表3。

表3高热病初期的治疗结果

从上表可以看出，50ppm以上溶菌酶含量的饲料添加剂对疾病的控制已经达到理想的控 制效果，而从实施例1能够看出单用50ppm溶菌酶，抑菌效果并不明显。可见，通过复合油 脂和中药组合物与其协同作用，使用更低的溶菌酶达到了更好的治疗效果，有效地控制了高 热症初期病情。

实施例4：免疫学观察

(一)提高免疫力功能测评动物实验

1、实验动物NIH小鼠20-22g，单一性别，SPF级，每组40只，共四组。

2、剂量分组及受试样品给予时间

实验设受试样品三个组和一个阴性对照组，每次灌胃1g.

试验组2(添加剂中含有溶菌酶，浓度为50ppm，添加剂中还有添加剂总量3％复合油脂 和2％中药组合物；所述复合油脂为DHA和亚麻油，DHA与亚麻油的比例为1：10；中药组 合物为白术25份、葛根14份、连翘11份、虎掌草2、山楂3份、苦参2份)；

对比组e(300ppm溶菌酶，不添加复合油脂和中药组合物)；

对比组f(不添加复合油脂，其他同试验组2)；设阴性对照组。受试样品用去离子水配制， 受试样品给予时间35天；

阴性对照组为去离子水。

3、试验方法

动物在实验室条件下检疫一周后，以下每个实验均为随机将40只鼠分成四组，每组10 只，每日灌胃给予受试物，给样量每周根据体重增减调整，实验时间为4周。

3.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验(MTT法)

脾细胞悬液制备：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank′s液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎， 制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用Hank′s液洗2次，每次 离心10min(1000r／min)。弃上清将细胞浆弹起，加入0.5mL灭菌水20秒，裂解红细胞后再 加入0.5mL2倍Hank’s液及8mLHank’s液，1000r／min，10min离心，然后将细胞悬浮于 1mL的完全培养液中，用1％冰醋酸稀释后计数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为 3～5×106个／mL。

淋巴细胞增殖反应：将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加 75μL ConA液(相当于7.5μg／mL)，另一孔作为对照，置5％CO2，37℃CO2孵箱中培养 72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPM11640 培养液，同时加入MTT(5mg／mL)50μL／孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸 性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行 孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，721分 光光度计上在波长570nm测定OD值。

3.2、小鼠迟发型变态反应(足跖增厚法)

试验结束前的第4天免疫动物及血清分离，用2％的绵羊红细胞腹腔注射0.2ml致敏动物， 5天后测定左后足跖部厚度，接着于该处皮下注射20％(v／v)绵羊红细胞(20ul／只)注射后 24h测定左后足跖厚度三次，得平均值。

3.3、小鼠血清溶血素的测定

末次给药后，用1：4稀释得印度墨汁，按体重从小鼠尾静脉注入稀释的印度墨汁

(10ml／kg)，注入墨汁后2、10min，分别从内眦静脉丛取血20μL，并立即将其加到2mL 0.1％Na2CO3溶液中。用721分光光度计在600nm波长处测光密度值(OD)，以Na2CO3溶液 作空白对照。

3.4、NK细胞活性测定：

脾细胞悬液得制备(效应细胞)：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank’s液的小平皿中， 用镊子轻轻将脾磨碎，制成单细胞悬液。经200目晒网过滤。Hank’s液洗3次，每次离心 10min(1000r／min)。然后将细胞悬浮于2ml的完全培养中，用台酚兰染色计数活细胞数(应 在95％以上)，最后用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为0.5×107个／ml。

NK细胞活性检测：取浓度为1×105个／ml的靶细胞和效应细胞各100ul(效靶比50：1)， 加入U型96孔培养板中；靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100ul，靶细胞最大释放孔 加靶细胞和1％NP40或2.5％Triton各100ul；上述各项均设三个平行孔，于37℃，5％CO2培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r／min离心5min，每孔吸取上清100ul置平底 96孔培养板中，同时加入LDH基质液100ul，根据室温不同反应3～10min，每孔加入1mol／L 的HCl30ul，在酶标仪490nm处测定光密度值(OD)。

数据处理：所有数据均经SPSS统计软件进行方差分析。

4、实验结果

表4增强免疫力试验结果

从表4可以看出本申请试验组2能够提高绵羊红细胞诱导的小鼠迟发型变态反应能力(足 跖增厚法)；使受试动物血清溶血素抗体滴度反应增加，增加受试动物的NK细胞活性。另外， 对照组f中药的使用能够有效提高小鼠的免疫力，但是效果低于同时还添加富含不饱和脂肪 酸复合油脂的试验组2，结果表明本申请试验组2与其他组相比具有显著的增强免疫力的功 效。

本文标签： 组合药物饲料添加剂用途溶菌酶