利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法

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本发明公开了一种利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，包括：将糙米或/和米糠经脱脂处理得到脱脂米粉；将脱脂米粉与氯化钠水溶液混合，混匀后经振荡提取、第一分离收集上清液，即为总盐溶性蛋白溶液；向总盐溶性蛋白溶液加入乙醇，混合均匀，经静置、第二分离后除去沉淀部分，得到生物活性蛋白溶液；将生物活性蛋白溶液经后处理除乙醇、除盐分以及干燥后得到稻米天然生物活性蛋白；将稻米天然生物活性蛋白作为活性成分，制备减肥食品。本发明方法，口服给予稻米天然生物活性蛋白能有效减少营养性肥胖个体的质量，制备减肥食品，具有减肥功效，具有实际利用价值，市场前景良好。

1.一种利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将糙米或/和米糠经脱脂处理得到脱脂米粉；2)将步骤1)中的脱脂米粉与氯化钠水溶液混合，混匀后经振荡提取、第一分离收集上清液，即为总盐溶性蛋白溶液；所述的第一分离的条件为：在5000～8000rpm离心10～30min；3)向步骤2)中的总盐溶性蛋白溶液加入乙醇，混合均匀，经静置、第二分离后除去沉淀部分，得到生物活性蛋白溶液；所述的总盐溶性蛋白溶液与乙醇的体积比为1：1～3；所述的第二分离的条件为：在7000～9000rpm离心10～30min；4)将步骤3)中的生物活性蛋白溶液经后处理除乙醇、除盐分以及干燥后得到稻米天然生物活性蛋白；5)将步骤4)中的稻米天然生物活性蛋白作为活性成分，制备减肥食品。 2.根据权利要求1所述的利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，其特征在于，步骤1)中，所述的脱脂处理包括：将糙米或/和米糠粉碎后过30～80目筛得到米粉原料，向米粉原料中加入丙酮脱脂，经振荡、分离、干燥后得到脱脂米粉。 3.根据权利要求2所述的利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，其特征在于，所述的米粉原料的质量与丙酮的体积比为1：2～4g/mL。 4.根据权利要求1所述的利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的氯化钠水溶液的浓度为0.5mol/L～1.5mol/L。 5.根据权利要求1所述的利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的脱脂米粉的质量与氯化钠水溶液的体积比为1：5～12g/mL。 6.根据权利要求1所述的利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的振荡提取的条件为：在20～40℃振荡提取2～4小时。 7.根据权利要求1所述的利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，其特征在于，步骤3)中，所述的静置的条件为：1～10℃静置0.5～1.5h。

技术领域

本发明涉及减肥食品的制备领域，具体涉及一种利用稻米天然生物活性 蛋白制备减肥食品的方法。

背景技术

肥胖症是一种慢性病，当人体摄取食物热量大于机体消耗量的时候，多 余热量就会以脂肪形式存储在体内导致体重增加继而发展为肥胖症。肥胖可 以引发多种疾病，如高血压、高血脂、冠心病、心绞痛、糖尿病、女性月经 不调等。随着人们饮食习惯的改变，肥胖症患者日益增多，我国城市居民中 肥胖及高血脂的发病率超过10%，并具有逐年增加和年轻化趋势。饮食控制 是减少肥胖的主要方法，以前认为限制饱和脂肪酸的摄入量有利于减肥，后 来发现低饱和脂肪酸饮食并不能达到降低体重的预期目的。最近研究表明， 减少碳水化合物摄入是减肥的有效方法，天然植物来源的α-淀粉酶抑制剂可 以减少糖向脂肪的转化，增加脂肪消耗以减轻体重，从而具有减肥功效 （Barrett M L and Udani J K.A proprietary alpha-amylase inhibitor from white  bean(Phaseous vulgaris):A review of clinical studies on weight loss and glycemic  control.NUTRITIONAL JOURNAL,2011,10:24；吴永宏等，小麦α-淀粉酶抑 制剂减肥作用的实验研究，生物加工过程，2006,4（3）：73-76)。

稻米蛋白是一种营养价值极高的食用蛋白，主要是大米蛋白的氨基酸构 成合理，其利用率和生物效价高，且具有低过敏性，是唯一可以免于过敏实 验的谷物蛋白。按照Osborne基于溶解性的分类方法，稻米蛋白可粗分为清 蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。其中清蛋白、球蛋白是稻米中能用氯化 钠溶解提取的蛋白组分，也称为盐溶性蛋白、是主要的生理活性蛋白（王良 东等．大米蛋白制备研究进展．粮食加工，2007，32(1)：43-47），已报道的 稻米蛋白酶解多肽和提取物的生理功效包括降血压、降血糖、清除胆固醇、 抗癌变等。

申请公布号为CN103110103A中国发明专利申请公布了一种具有清脂 减肥的营养餐粉，是由胶原蛋白粉2.5g～3.5g、大麦苗粉3g～4g、魔芋胶粉 1.5g～2.5g、香菇多糖粉1g～1.5g、红曲米提取物粉1g～2g、燕麦全粉 11.9g～12.9g、南瓜粉2g～3g、山药粉1.5g～2.5g、荷叶粉0.75g～1.5g、乳酸钙 粉0.05g～0.1g、食盐细粉0.4g～0.6g混合而成。上述具有清脂减肥的营养餐 粉虽然具有一定改善降血脂、改善脂肪肝、减肥瘦身的营养餐粉的作用，但 是其制备成本很高，不利于市场化大规模推广利用。

发明内容

本发明提供了一种利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，采 用氯化钠和乙醇两种食品级原料，能够从糙米或米糠中提取稻米天然生物活 性蛋白，低成本，无污染，再将稻米天然生物活性蛋白作为有效成分，制备 减肥食品，具有清脂减肥的功效。

一种利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，包括以下步骤：

1）将糙米或/和米糠经脱脂处理得到脱脂米粉；

2）将步骤1）中的脱脂米粉与氯化钠水溶液混合，混匀后经振荡提取、 第一分离收集上清液，即为总盐溶性蛋白溶液；

3）向步骤2）中的总盐溶性蛋白溶液加入乙醇，混合均匀，经静置、第 二分离后除去沉淀部分，得到生物活性蛋白溶液；

4）将步骤3）中的生物活性蛋白溶液经后处理除乙醇、除盐分以及干燥 后得到稻米天然生物活性蛋白；

5）将步骤4）中的稻米天然生物活性蛋白作为活性成分，制备减肥食品。

本发明中，先采用氯化钠水溶液对米总盐溶性蛋白提取，得到总盐溶性 蛋白溶液，再采用乙醇对总盐溶性蛋白溶液除稻米天然生物活性蛋白以外的 杂蛋白进行沉淀除杂，从而经过后处理后得到纯度较高的稻米天然生物活性 蛋白，最后将稻米天然生物活性蛋白作为有效成分，制备减肥食品。

步骤1）中，脱脂米粉可采用市售产品也可自行制备，作为优选，所述 的脱脂处理包括：将糙米或/和米糠粉碎后过30～80目（进一步优选40～50 目）筛得到米粉原料，向米粉原料中加入丙酮脱脂，经振荡、分离、干燥后 得到脱脂米粉。经过上述粒径大小的筛选并经丙酮脱脂得到的脱脂米粉，有 利于从脱脂米粉提取稻米天然生物活性蛋白。进一步优选，所述的米粉原料 的质量与丙酮的体积比为1：2～4g/mL，即米粉原料与丙酮的固液比1：2～4 g/mL，进一步优选，为1：3g/mL，采用上述质量的丙酮，有利于后续稻米 天然生物活性蛋白的提取。

步骤2）中，采用氯化钠水溶液对脱脂米粉总盐溶性蛋白提取，作为优 选，所述的氯化钠水溶液的浓度为0.5mol/L～1.5mol/L，蛋白质在水中溶解 度取决于蛋白质分子上离子基团周围的水分子数目，即取决于蛋白质的水合 程度。采用不同浓度的中性盐溶液可以控制稻米蛋白的水合程度，也就是控 制稻米蛋白质的溶解度。当水中加入少量盐时，盐离子与水分子对蛋白质分 子的极性基团的影响，使蛋白质在水中溶解度增大，此即盐溶现象；但盐浓 度增加一定程度时，水的活度降低，蛋白质表面的电荷大量被中和，水化膜 被破坏，于是蛋白质相互聚集而沉淀析出，这就是盐析。本发明选用的中性 盐为氯化钠，水溶液中合适的氯化钠浓度是影响稻米总盐溶性蛋白提取率的 关键，0.5mol/L～1.5mol/L浓度的氯化钠水溶液有利于盐溶性蛋白提取，稻 米总盐溶性蛋白得率较高。

所述的脱脂米粉的质量(g)与氯化钠水溶液的体积(mL)比为1：5～12 g/mL，即脱脂米粉与氯化钠水溶液的固液比1：5～12g/mL，固液比是指脱 脂米粉的质量(g)和氯化钠水溶液的体积(mL)的比值。当固液比较小的情况 下，少量的NaCl溶液不利于蛋白的充分溶解；过高的固液比（高于1:12） 不利于后续的浓缩、干燥，并使能耗增加。固液比1：5～12g/mL下，稻米 总盐溶性蛋白得率较高。

作为优选，所述的振荡提取的条件为：在20～40℃振荡提取2～4小时， 该振荡温度可提高蛋白溶解速率，并且提取2～4小时，使得稻米总盐溶性蛋 白得率较高。

作为优选，所述的第一分离的条件为：在5000～8000rpm离心10～30min， 第一分离的目的是将溶解于氯化钠水溶液的总盐溶性蛋白提取液与不溶性 糙米粉残渣分开，离心力与离心时间会影响残渣沉淀的效果，离心转速过低 或时间过短，残渣沉淀不完全，导致提取液浑浊不利于后期分离，离心转速 过高时间过长，使能耗增加并导致离心产热引起蛋白变性甚至淀粉糊化，在 5000～8000rpm离心10～30min能保证最佳分离效果。

步骤3）中，采用乙醇对总盐溶性蛋白溶液除稻米天然生物活性蛋白以 外的杂蛋白进行沉淀除杂，作为优选，所述的总盐溶性蛋白溶液与乙醇的体 积比为1：1～3。乙醇引起蛋白质沉淀的原因：一方面是由于乙醇加入水中使 溶剂介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力；另一方面是因为乙醇是强亲 水试剂，争夺蛋白质分子表面的水化水，破坏蛋白质胶体分子表面的水化层 而使分子聚集沉淀，选用乙醇进行杂蛋白的沉淀能保证分离蛋白的食用和应 用安全性。一般来说乙醇的浓度多少，与能沉淀的杂蛋白的分子量有关。当 总盐溶性蛋白溶液与乙醇的体积比为1：1～3时，稻米总盐溶性蛋白提取液 中20kDa以上的杂蛋白沉淀越来越完全，而具有生物活性的10～18kDa低分 子量盐溶蛋白亚组分（即所要提取的稻米天然生物活性蛋白）保留在溶液上 清中，纯度较高。总盐溶性蛋白溶液与乙醇的体积比1：1～3的范围能保证 不同糙米或米糠原料中低分子量生物活性蛋白亚组分的提取效果。

作为优选，所述的静置的条件为：1～10℃静置0.5～1.5h，使得杂蛋白 形成沉淀，有利于后续的过程中除去。温度降低使杂蛋白的溶解性降低更容 易沉淀去除，同时利于保持目标蛋白的生物活性；静置时间越长，杂蛋白沉 淀效果越好，在1～10℃静置0.5～1.5h，能保证稻米中20kDa以上的杂蛋白 沉淀有效去除。

作为优选，所述的第二分离的条件为：在7000～9000rpm离心10～30min， 第二分离的目的是将上述乙醇沉淀的20kDa以上的杂蛋白与溶解在上清中 的稻米低分子量生物活性蛋白（即所要提取的稻米天然生物活性蛋白）分开， 离心力与离心时间会影响沉淀的效果，离心转速过低或时间过短，沉淀与上 清不能完全分开，导致部分杂蛋白残留在上清中，降低目标蛋白纯度。离心 转速过高时间过长，使能耗增加，工艺延长，在5000～8000rpm离心10～30min 能使杂蛋白沉淀与上清液更好的分离，保证稻米天然生物活性蛋白的提取纯 度。

步骤4）中，所述的后处理除乙醇、除盐分以及干燥包括：离心真空浓 缩法去除乙醇、透析除去盐分以及冷冻干燥。经后处理得到的稻米天然生物 活性蛋白，为低分子量生物活性蛋白干粉，方便储存、运输和使用。稻米天 然生物活性蛋白，为低分子量生物活性蛋白干粉，呈白色或黄白色，无味， 经SDS（十二烷基硫酸钠）-聚丙烯凝胶电泳分析检测蛋白分子量范围为10 kDa～18kDa（10000道尔顿～18000道尔顿）。

步骤5）中，将稻米天然生物活性蛋白作为活性成分，制备减肥食品。 所述的活性成分即为对人体有益的成分，即在本发明中，为对人体起到清脂 减肥功效的成分。稻米天然生物活性蛋白具有α-淀粉酶抑制活性，口服给予 稻米天然生物活性蛋白能有效减少营养性肥胖个体的质量，具有减肥功效。 在制备减肥食品时，将稻米天然生物活性蛋白作为减肥食品的有效成分，减 肥食品包括减肥保健食品和减肥普通市售食品，减肥保健食品可以为粉剂、 颗粒剂、胶囊、片剂、丸剂或口服液，减肥普通市售食品为淀粉制品、乳制 品、豆制品、烘焙食品或饮料。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

本发明利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，采用氯化钠和 乙醇两种食品级原料，能够从糙米或米糠中提取稻米天然生物活性蛋白，低 成本，无污染，稻米天然生物活性蛋白在体外具有抑制胰α-淀粉酶的活性， 口服给予稻米天然生物活性蛋白能有效减少营养性肥胖个体的质量，具有减 肥功效，可将稻米天然生物活性蛋白作为有效成分，制备减肥食品，具有减 肥功效，具有实际利用价值，市场前景良好。

本发明利用稻米天然生物活性蛋白制备减肥食品的方法，制备简单，可 控性好，易于操作和实施，易于工业化大规模生产，具有广阔的应用前景和 良好的经济效益。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明做进一步的具体说明，但应该理解本发明 并不受这些内容所限制。

本实施例中未特别说明，百分数均为质量百分数。

实施例1：

1）采用市售的北大荒绿色食品配送有限公司的北大荒绿野有机糙米为 原料，粉碎后过40目筛，得到米粉原料，选用丙酮对米粉原料进行脱脂， 米粉原料（g)与丙酮(mL)固液比1:3g/mL，振荡2h后6000rpm离心20min 收集沉淀，置于通风橱自然风干即可得到脱脂米粉。

2）米总盐溶性蛋白提取：称取脱脂米粉15g加入1.0mol/L NaCl水溶液 120mL，充分混匀后，40℃振荡提取2h，6000rpm离心20min收集上清 液，重复步骤2）一次，合并上清液，得到总盐溶性蛋白溶液；

3）乙醇沉淀除杂：向步骤2）中的总盐溶性蛋白溶液加入无水乙醇，总 盐溶性蛋白溶液与无水乙醇的体积比为1：2，同时用磁力搅拌器搅拌混匀， 放置4℃条件下沉淀1h，8000rpm离心20min，去除沉淀部分，收集上清 即得到生物活性蛋白溶液；

4）后处理除乙醇、除盐分以及干燥：上述步骤3）中获得的生物活性蛋 白溶液采用离心真空浓缩法除去溶液中的乙醇，再将已除去乙醇的溶液装入 透析袋对蒸馏水透析3小时除去盐分，最后经冷冻干燥得到稻米天然生物活 性蛋白，为黄白色的干粉。稻米天然生物活性蛋白的得率为1.5mg/g脱脂米 粉。

实施例2：

1）采用市售的北大荒绿色食品配送有限公司的北大荒绿野有机糙米为原 料，粉碎后过50目筛，得到米粉原料，选用丙酮对米粉原料进行脱脂，米 粉原料（g)与丙酮(mL)固液比1:3g/mL，振荡2h后6000rpm离心20min 收集沉淀，置于通风橱自然风干即可得到脱脂米粉；

2）米总盐溶性蛋白提取：称15g脱脂米粉加入1.0mol/L NaCl水溶液 150mL，充分混匀后，30℃振荡提取2h，6000rpm离心20min收集上清 液，重复步骤2）一次，合并上清液，得到总盐溶性蛋白溶液；

3）乙醇沉淀除杂：向步骤2）中的总盐溶性蛋白溶液加入无水乙醇，总 盐溶性蛋白溶液与无水乙醇的体积比为1：2，同时用磁力搅拌器搅拌混匀， 放置4℃条件下沉淀1h，8000rpm离心20min，去除沉淀部分，收集上清 即得到生物活性蛋白溶液；

4）后处理除乙醇、除盐分以及干燥：上述步骤3）中获得的生物活性蛋 白溶液采用离心真空浓缩法除去溶液中的乙醇，再将已除去乙醇的溶液装入 透析袋对蒸馏水透析2小时除去盐分，最后经冷冻干燥得到稻米天然生物活 性蛋白，为黄白色的干粉。稻米天然生物活性蛋白的得率为1.8mg/g脱脂米 粉。

实施例3：

1）采用市售的江西省天玉油脂有限公司生产的精细脱脂米糠粉为原料， 作为脱脂米粉；

2）米总盐溶性蛋白提取：准确称取15g脱脂米粉加入1.0mol/L NaCl 水溶液150mL，充分混匀后，30℃振荡提取2h，6000rpm离心20min收 集上清液，重复步骤2）一次，合并上清液，得到总盐溶性蛋白溶液；

3）乙醇沉淀除杂：向步骤2）中的总盐溶性蛋白溶液加入无水乙醇，总 盐溶性蛋白溶液与无水乙醇的体积比为1：2.5，同时用磁力搅拌器搅拌混匀， 放置4℃条件下沉淀1h，8000rpm离心20min，去除沉淀部分，收集上清 即得到生物活性蛋白溶液；

4）后处理除乙醇、除盐分以及干燥：上述步骤3）中获得的生物活性蛋 白溶液采用离心真空浓缩法除去溶液中的乙醇，再将已除去乙醇的溶液装入 透析袋对蒸馏水透析3小时除去盐分，最后经冷冻干燥得到稻米天然生物活 性蛋白，为黄白色的干粉。稻米天然生物活性蛋白的得率为6.2mg/g脱脂米 粉（即精细脱脂米糠粉）。

实施例4：

1）采用市售的江西省天玉油脂有限公司生产的精细脱脂米糠粉为原料， 作为脱脂米粉；

2）米总盐溶性蛋白提取：准确称取15g脱脂米粉加入0.5mol/L NaCl 水溶液75mL，充分混匀后，20℃振荡提取4h，5000rpm离心30min收集 上清液，重复步骤2）一次，合并上清液，得到总盐溶性蛋白溶液；

3）乙醇沉淀除杂：向步骤2）中的总盐溶性蛋白溶液加入无水乙醇，总 盐溶性蛋白溶液与无水乙醇的体积比为1：1，同时用磁力搅拌器搅拌混匀， 放置1℃条件下沉淀0.5h，7000rpm离心30min，去除沉淀部分，收集上 清即得到生物活性蛋白溶液；

4）后处理除乙醇、除盐分以及干燥：上述步骤3）中获得的生物活性蛋 白溶液采用离心真空浓缩法除去溶液中的乙醇，再将已除去乙醇的溶液装入 透析袋对蒸馏水透析3小时除去盐分，最后经冷冻干燥得到稻米天然生物活 性蛋白，为黄白色的干粉。稻米天然生物活性蛋白的得率为4.1mg/g脱脂米 粉（即精细脱脂米糠粉）。

实施例5：

1）采用市售的江西省天玉油脂有限公司生产的精细脱脂米糠粉为原料， 作为脱脂米粉；

2）米总盐溶性蛋白提取：准确称取15g脱脂米粉加入0.5mol/L NaCl 水溶液180mL，充分混匀后，40℃振荡提取2h，8000rpm离心10min收 集上清液，重复步骤2）一次，合并上清液，得到总盐溶性蛋白溶液；

3）乙醇沉淀除杂：向步骤2）中的总盐溶性蛋白溶液加入无水乙醇，总 盐溶性蛋白溶液与无水乙醇的体积比为1：3，同时用磁力搅拌器搅拌混匀， 放置10℃条件下沉淀1.5h，9000rpm离心10min，去除沉淀部分，收集上 清即得到生物活性蛋白溶液；

4）后处理除乙醇、除盐分以及干燥：上述步骤3）中获得的生物活性蛋 白溶液采用离心真空浓缩法除去溶液中的乙醇，再将已除去乙醇的溶液装入 透析袋对蒸馏水透析3小时除去盐分，最后经冷冻干燥得到稻米天然生物活 性蛋白，为黄白色的干粉。稻米天然生物活性蛋白的得率为4.7mg/g脱脂米 粉（即精细脱脂米糠粉）。

一、分子量范围确定：

采用蛋白质分子量测定的常规方法即十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶 电泳（SDS-PAGE)法，操作参照江绍玫等的文献（江绍玫，朱速松，刘世家， 等．水稻谷蛋白突变体的筛选及遗传分析．遗传学报，2003，30(7)：641-645） 所列的方法，对实施例所制备的稻米天然生物活性蛋白进行分子量分析。

SDS-PAGE凝胶浓度：分离胶15%，浓缩胶5%；

样品制备：取按照本发明实施例所制备的稻米天然生物活性蛋白溶入蒸 馏水制成蛋白含量为0.5μg/μL的溶液，取100μL蛋白溶液（蛋白含量为50 μg）与25μL蛋白上样混合液[由5μL质量浓度为5%的β-巯基乙醇水溶液、 5μL质量浓度为0.5%的溴酚蓝水溶液、5μL质量浓度为10%的SDS水溶液、 5μL质量浓度为50%的甘油水溶液以及5μL浓度为250mmol/L Tris-HCl缓 冲液（pH6.8）混合得到]混匀，煮沸5min后15000rpm离心15min，取20 μL上清加样于凝胶上进行电泳，同时将蛋白质标准分子量溶液、实施例中 步骤2）中的总盐溶性蛋白溶液以及步骤3）生物活性蛋白溶液分别加样电 泳，每个样品孔中加入的蛋白量为50μg。

电泳条件：恒压150V，电泳1.5～2小时；

凝胶染色和脱色：电泳后的凝胶用考马斯亮蓝R-250染色液（称取0.6g 考马斯亮蓝R-250溶解于含25%无水乙醇、8%乙酸的脱色液中配成染色液， 经滤纸过滤后使用）染色4小时，再用脱色液（25%无水乙醇、8%乙酸）脱 色过夜，并观察凝胶电泳图。

根据其凝胶电泳图可知，通过与蛋白质标准分子量对比，可到本发明实 施例1～5得到的稻米天然生物活性蛋白在13kDa～16kDa，其中，在步骤2） 中的总盐溶性蛋白溶液中，其除稻米天然生物活性蛋白还有高于16kDa分 子量的杂蛋白，步骤3）生物活性蛋白溶液，主要就是分子量在13kDa～16kDa 的稻米天然生物活性蛋白。

二、稻米天然生物活性蛋白抑制胰α-淀粉酶活性的确定

将采用上述实施例1制备的稻米天然生物活性蛋白（干粉）用无菌蒸馏 水配制成2mg/mL的蛋白溶液，取100ul作为测定液，按照徐亲民等发表论 文（徐亲民等，植物中胰α-淀粉酶抑制剂的筛选，中国医药工业杂志，1991， 22（7）：302-303）中描述的方法测定蛋白溶液对牛胰α-淀粉酶的抑制活性。

胰α-淀粉酶酶液的制备：称取牛新鲜胰脏50g在绞肉机中绞碎，加入 50mL0.01mol/L磷酸盐缓冲液中，搅拌匀浆，加入丙酮500mL，继续搅拌 30分钟，然后静置10分钟，除去上清，再加入250mL丙酮，搅拌20分钟， 双层纱布过滤，得沉淀，将沉淀放在滤纸上抽滤干燥，放置到干燥无菌玻璃 瓶密闭，冰箱中保存。取牛胰丙酮干粉100mg，与10mLpH6.9的0.02mol/L 磷酸缓冲液（含6mmol/L NaCl)混匀，4℃条件下8000rpm离心10分钟，得 上清即为胰α-淀粉酶原液，用pH6.9的0.02mol/L磷酸缓冲液（含6mmol/L  NaCl)稀释10倍后为牛胰α-淀粉酶工作液。

测定体系：取牛胰α-淀粉酶工作液0.1mL，待测蛋白溶液0.1mL，于37℃ 保温10min,冰上冷却至0℃，加碘液（取碘1.27g和KI3.0g溶于适量蒸馏 水中，加入浓盐酸1mL，用蒸馏水稀释到100mL）1mL及蒸馏水5mL，立 即在660nm波长下测定光吸收度。另外分别以牛胰α-淀粉酶工作液0.1mL+ 蒸馏水0.1mL作为无待测样品对照组A，以pH6.9的0.02mol/L磷酸缓冲液 （含6mmol/L NaCl)+蒸馏水0.1mL作为无酶的空白对照组B。

待测蛋白样品胰α-淀粉酶抑制活性的计算：

抑制率=【（实验组吸光度S-空白对照B吸光度）/（对照组A吸光度-空 白对照B吸光度）】×100%；

结果表明，当蛋白浓度为2.0mg/mL时，抑制率为76%。

实施例2～5制备的稻米天然生物活性蛋白重复上述步骤，当蛋白浓度为 2.0mg/mL时，实施例2的抑制率为77%，实施例3的抑制率为78%，实施 例4的抑制率为74%，实施例5的抑制率为75%。

上述将稻米天然生物活性蛋白（干粉）用无菌蒸馏水配制成2mg/mL的 蛋白溶液，即可视为一种口服液。当然口服液可以经过本领域技术人员根据 本领域知识加入其它辅助成分通过有限次实验优化。

通过实验结果可知，稻米天然生物活性蛋白在体外具有抑制胰α-淀粉酶的 活性。由于文献研究已证明天然植物来源的α-淀粉酶抑制剂可以减少糖向脂 肪的转化，增加脂肪消耗以减轻体重，从而具有减肥功效（Barrett M L and  Udani J K.A proprietary alpha-amylase inhibitor from white bean(Phaseous  vulgaris):A review of clinical studies on weight loss and glycemic control. NUTRITIONAL JOURNAL,2011,10:24；吴永宏等，小麦α-淀粉酶抑制剂减 肥作用的实验研究。生物加工过程，2006,4（3）：73-76)，因此，采用本发 明制备的稻米天然生物活性蛋白可作为减肥疗效活性成分，可制备减肥食 品。

三、稻米天然生物活性蛋白减肥功效的确定

参照吴永宏等已发表研究论文（吴永宏等，小麦α-淀粉酶抑制剂减肥 作用的实验研究，生物加工过程，2006,4（3）：73-76）描述的方法测定采用 本发明技术制备的稻米天然生物活性蛋白的减肥功效。

实验动物：SD大鼠，175-210g。肥胖大鼠模型制备：给SD大鼠饲喂高 脂高糖饲料（5%奶粉、12%猪油、5%蔗糖、10%鸡蛋黄、1%牛胆盐、5%花 生、1%麻油、2%食盐、59%基础饲料），饲养四周，每周称体重，造模后大 鼠体重增加20%以上表示造模成功。

对造模成功的肥胖型小鼠分为肥胖模型对照组和实验组两组，肥胖模型 对照组大鼠除正常喂食外，每天口服灌胃同体积的生理盐水；其中实验组即 口服稻米天然生物活性蛋白组又分为（100、150、200mg/kg体重)三组，每 天口服灌胃用同体积生理盐水溶解的稻米天然生物活性蛋白溶液。连续灌胃 4周，每周测量大鼠体重质量。每组大鼠3只。

结果表明，当实验组大鼠口服稻米天然生物活性蛋白剂量为200mg/kg 体重时，4周后，大鼠体重质量平均值比实验前降低9%，差异极显著（P<0.01)， 而相同条件下模型对照组大鼠体重质量比实验前上升2.4%。表明本发明制 备的稻米天然生物活性蛋白具有减肥功效。稻米天然生物活性蛋白溶于生理 盐水，可视为口服液制剂，因此，稻米天然生物活性蛋白可用于制备减肥食 品。

本文标签： 稻米活性蛋白生物方法