含有益生微生物的宠物食物制品

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本发明涉及宠物食物领域。特别的是，本发明提供了包含非复制型益生微生物的宠物食物组合物。这些非复制型益生微生物可以是例如生物活性的热处理过的益生微生物。本发明还涉及由这些非复制型益生微生物提供的健康益处。

1.包含非复制型益生微生物的宠物食物组合物，所述益生微生物的量相当于每份约10至10cfu。 2.根据权利要求1的宠物食物组合物，其大约包含约4至40重量％的干重脂肪、约12至70重量％的干重糖类和约12至约50重量％的干重蛋白质。 3.根据权利要求2的宠物食物组合物，其大约包含约10至20重量％的干重脂肪、约30至60重量％的干重糖类和约20至约35重量％的干重蛋白质。 4.根据前述项权利要求之一的宠物食物组合物，其还包含约0.5至40重量％干重，优选约0.5至30重量％干重，更优选约1至20重量％干重，最优选约1至10重量％干重的膳食纤维。 5.根据前述项权利要求之一的宠物食物组合物，其中宠物食物组合物选自宠物食物、宠物营养饮食、宠物补充剂、宠物零食和宠物的食物玩具，如可咀嚼和可消耗的玩具。 6.根据前述项权利要求之一的宠物食物组合物，其还包含益生元，例如低聚果糖和菊粉。 7.根据前述项权利要求之一的宠物食物组合物，其中益生微生物是通过热处理成为非复制型的，优选通过在至少71.5℃处理至少1秒的高温处理。 8.根据权利要求7的宠物食物组合物，其中热处理为在约71.5-150℃处理约1-120秒的高温处理，并且优选为高温/短时(HTST)处理或超高温(UHT)处理。 9.根据权利要求8的宠物食物组合物，其用于预防或治疗炎性疾病。 10.根据权利要求7的宠物食物组合物，其中热处理在约70-150℃温度范围内进行约3分钟-2小时，优选在80-140℃范围内进行5分钟-40分钟。 11.根据权利要求10的宠物食物组合物，其用于预防或治疗与受损的免疫防御相关的疾病。 12.根据前述项权利要求之一的宠物食物组合物，其中至少90％、优选至少95％、更优选至少98％、最优选至少99％、理想地至少99.9％、最理想地全部益生菌为非复制型的。 13.根据前述项权利要求之一的宠物食物组合物，其中益生微生物选自双歧杆菌属(bifidobacteria)、乳杆菌属(lactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria)或它们的组合，例如长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus johnsonii)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、双乙酰乳酸乳球菌(Lactococcus diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和/或它们的混合物。 14.根据前述项权利要求之一的宠物食物组合物，其中益生微生物选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约汉逊氏乳杆菌La1、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏乳杆菌DSM17938、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌ACA-DC6002(NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌NCC15、乳酸乳球菌NCC2287，或它们的组合。 15.根据前述项权利要求之一的宠物食物组合物，其每日剂量含有约0.005mg-1000mg非复制型微生物。

本发明涉及宠物食物领域。特别是本发明提供了包含非复制型益生微 生物的宠物食物组合物。这些非复制型益生微生物可以是例如生物活性的 热处理过的益生微生物。本发明还涉及由这些非复制型益生微生物提供的 健康益处。

同时，益生菌的健康益处是本领域普遍接受的，由例如Blum等人概 括在Curr Issues Intest Microbiol.2003Sep；4(2)：53-60中。通常，在共生制 剂中同时施用益生菌和益生元，所述制剂甚至可以具有增强的健康益处。

驯养动物的健康状态与其喂养密切相关。正确的喂养应该导致强壮健 康的宠物。除了提供营养价值外，食物组合物影响肠道微生物群平衡，可 以导致或阻止胃肠道疾病。因此，关于健康动物的胃肠道和消化过程的知 识对于理解喂养实践行为是必需的。

通常，犬科和猫科动物的胃肠道疾病与细菌过度生长以及病原菌产生 的肠毒素生成相关。

在过去若干年间，研究关注于一些有价值的乳酸细菌菌株，及其作为 益生剂的潜在用途。益生菌被认为是活的微生物制品，通过保护肠道内的 天然微生物群，促进哺乳动物健康。益生菌被认为吸附在肠道粘膜上，在 肠道形成集落，从而阻止有害微生物吸附至其上。其作用的先决条件在于 必须以正确和存活的形式到达肠道粘膜，尤其是未被遍布胃中的低pH影 响而破坏。特别的是，猫和狗的消化道生理学不同于人。例如，胃内的平 均pH是约3.4(狗)和4.2(猫)。

美国专利7189390描述了基于益生菌潜力而选择和分离的新的乳酸菌 微生物，及其用于制备预期改善宠物健康的宠物食物组合物的用途。

由于多达70％的免疫系统包含在动物的消化道内，益生菌不仅有助于 动物的消化健康，而且有助于宠物的整个免疫系统。

已知益生菌能够吸附至肠细胞上，并排除肠细胞上的病原菌。为了产 生该活性，益生菌必须在产品中一直保持存活直至其被消化。向宠物食物 粗粒中添加活菌使其保持存活至产品消耗，并且在到达肠道时细菌仍然存 活仍然是一大挑战，需要大量的技术努力予以实现。

需要即使在益生菌临界条件下储藏较长时期后，仍然能够递送益生菌 益处的宠物食物组合物，该组合物同时是易于制备的。优选的是使用这样 的天然成分来实现，所述天然成分对施用安全无副作用，且易于使用现有 产业技术被掺入到宠物食物组合物中。

还需要进一步改善这类制品中的益生菌的免疫强化效应。

还需要进一步改善这类制品中的益生菌的抗炎效应。

本发明人已经满足了上述需求。因此，本发明的目的是改善现有技术， 提供满足上述需求的宠物食物组合物。

本发明人令人惊讶的发现：可以通过独立权利要求的主题实现这一目 的。独立权利要求进一步发展了本发明的观点。

本发明人能够显示：即使是非复制型益生菌也能提供益生菌的健康益 处，甚至可具有改善的益处。

因此，保持最终产品中的益生菌存活，以及确保其活着到达肠道的复 杂手段似乎不是必需的。

相应的，本发明人提出了提供包含非复制型益生微生物的宠物食物组 合物。

出于本发明的目的，宠物食物组合物包括多种组合物，例如食物、营 养餐、补充剂、零食(treat)和食用玩具，如可咀嚼和可食用的玩具。

出于本发明的目的，宠物包括驯养动物(domestic animal)，例如狗、 猫、鸟、兔、天竺鼠(guinea pig)、羊、牛、马、猪。

在一些实施方案中，组合物是具有任何合适形态的食物，例如液体或 固体食物。当食物是液体食物时，非复制型益生微生物可以与食物混合。 当食物是固体食物时，非复制型益生微生物可以包被在食物上、掺入到食 物中、或两者。当包被在食物上或掺入到食物中时，非复制型益生微生物 可以是均质的或不均质的分散在食物之中或之上。

本发明的宠物食物组合物通常含有糖类级分、蛋白质级分和脂肪级分。

除非另外指出，百分比是基于干物质的重量％。

宠物食物组合物可包含约12％至约70％，优选约16％至约65％，更 优选约20％至约60％，最优选约30％至约60％的糖类级分；约12％至约 50％，优选约16％至约45％，更优选约18％至约40％，最优选约20％至 约35％的蛋白质级分；和约4％至约40％，优选约6％至约30％，更优选 约8％至约25％，最优选约10％至约20％的脂肪级分。

对于一些宠物食物组合物(例如宠物零食)，组合物可以含有约1至 约12％脂肪，通常是包衣的形式，以增强适口性。

宠物食物组合物还可以包含约0.5％至约40％，优选约0.5％至约30％， 更优选约1％至约20％，最优选约1％至约10％的膳食纤维。

可以添加营养平衡剂(即，维生素、矿物质、痕量元素及其组合)。 通常这类营养平衡剂添加的量可以是约0.01％至约15％，优选约0.05％至 约10％，更优选约1％至约5％，最优选约1％至约3％。

组合物中各种成分特别合适的量取决于多种因素，例如消耗组合物的 动物种类；包括在组合物中的特定成分；动物的年龄、体重、健康状况、 性别和饮食；动物的消耗速率(consumption rate)等。因此，成分的量可以 大幅度变化，甚至可以偏离本文给出的比例。这类组分和组分的量的选择 落入本领域技术人员的知识范围内。对于一些伴侣动物(例如狗和猫)， 美国饲料控制办公室(American Feed Control Officials，AAFCO)提供了 这类成分的推荐量。

可以从多种来源获得蛋白质食物来源，所述来源例如植物、动物或两 者。动物蛋白质包括肉、肉类副产品、乳和蛋。肉包括禽肉、鱼肉、和动 物的肉，如牛肉、猪肉、绵羊肉、山羊肉等。肉类副产品包括肺、肾、脑、 肝、胃和肠。蛋白质食物成分还可以是游离的氨基酸和/或肽。优选的，蛋 白质食物成分包括肉、肉类副产品、乳产品或蛋。

可以从多种来源获得脂肪和糖类食物来源，所述来源例如动物脂肪、 鱼油、植物油、肉、肉类副产品、谷类、其他的动物或植物来源，及其混 合物。谷类包括小麦、玉米、大麦和稻。

可以从多种来源获得纤维食物成分，例如植物纤维来源，如纤维素、 甜菜渣(beet pulp)、花生壳和大豆纤维。

特别是当组合物是动物食物时，优选包含维生素和矿物质，其量需要 避免缺乏和保持健康。上述量是本领域中易于获得的。美国国家研究协会 (National Research Council，NRC)提供了农场动物的上述成分的推荐 量。参见例如Nutrient Requirements of Swine(10th Rev.Ed.，Nat’l Academy Press，Wash.D.C.，1998)；Nutrient Requirements of Poultry(9th  Rev.Ed.，Nat’l Academy Press，Wash.D.C.，1994)；Nutrient Requirements  of Horses(5th Rev.Ed.，Nat’l Academy Press，Wash.D.C.，1989)等。美国饲 料控制办公室(AAFCO)提供了狗和猫的上述成分的推荐量。参见 American Feed Control Officials，Inc.，Official publication，第126-140页 (2003)。一般可用作食物添加剂的维生素包括维生素A、维生素B1、维生 素B2、维生素B6、维生素B12、维生素C、维生素D、维生素E、维生 素H(生物素)、维生素K、叶酸、肌醇、烟酸和泛酸。一般可用作食物添 加剂的矿物质和痕量元素包括钙、磷、钠、钾、镁、铜、锌、胆碱和铁。

组合物可含有熟练的技术人员已知的其他成分，如维生素、矿物质、 填充剂(filler)、适口性增强剂、粘合剂、风味剂(flavors)、稳定剂、乳化剂、 甜味剂、着色剂、缓冲剂、盐、包衣剂等。稳定剂包括倾向于增加组合物 货架期的物质，如防腐剂、增效剂和螯合剂、包装气体、稳定剂、乳化剂、 增稠剂、胶凝剂和湿润剂。乳化剂和/或增稠剂的实例包括明胶、纤维素醚 类、淀粉、淀粉酯、淀粉醚和修饰的淀粉。各种组合物组分、食物成分和 其他成分的具体量取决于多种因素，如包括在组合物中的特定组分和成分； 患者种类；患者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；患者的消耗速率； 待治疗的疾病类型(如果有)等。因此，成分的量可以大范围的变化，可 以偏离本文描述的优选比例。组合物中这类添加剂的量通常多达重量的约 5％。

组合物可以是或可以含有其他成分，所述成分预期维持或改善动物的 健康，例如补充剂、药物、草药、整体药物(holistic drug)和组合物等.

用于本发明的补充剂包括与另一种饲料一起使用的饲料，用于改善整 体的营养平衡或性能。补充剂包括这样的组合物，所述组合物作为其他饲 料的补充剂不稀释喂养，从而为分开获得的动物的定量配给的其他部分提 供自由选择，或者稀释并与动物的日常饲料混合以产生完全喂养。在 American Feed Control Officials，Inc.Official Publication，第220页(2003) 中，AAFCO提供了涉及补充剂的讨论。补充剂可以是各种形式，包括粉 末、液体、糖浆、丸剂、胶囊化组合物等.

零食包括在非进餐时间给予动物，诱使动物进食的组合物，例如犬科 动物的狗骨。零食可以是有营养的，其中，组合物包含一种或多种营养物， 并可以具有上述用于食物的组成。无营养的零食涵盖了任何其他无毒的零 食。非复制型益生微生物包被在零食上，掺入到零食中，或两种情况并存。

玩具包括可咀嚼型玩具，如人造骨(artificial bone)。非复制型益生 微生物可以在玩具的表面或在玩具组分的表面上形成包衣，部分或整个掺 入贯穿玩具，或两种情况并存。在一个实施方案中，非复制型益生微生物 是预期的使用对象口服可及的。目前有多种合适的玩具在售，例如美国专 利号5,339,771、美国专利号5,419,283及其中公开的参考文献。本发明提 供了部分可消耗的玩具，如包含塑料组分的玩具，和全部可消耗的玩具， 如生皮玩具和各种人造骨。此外，本发明提供了用于人和非人用途的玩具， 特别是用于伴侣动物、农场动物和动物园动物用途的玩具，特别是用于狗、 猫和鸟类用途的玩具。

在制备本发明的组合物中，调节组分使得按组合物的重量计，组合物 中存在的非复制型益生微生物的浓度为至少0.01％，优选约0.01％至约 4％，最优选约0.5％至约2％。可以在加工制剂的过程中，将非复制型益 生微生物掺入到组合物中，如混合组合物的其他组分的过程中和/或之后。 通过常规手段实现这些组分在组合物中的分布。

可使用常规方法，制备干燥形式的本发明的组合物(特别是食物)。 在一个实施方案中，研磨干燥成分，包括动物蛋白质来源、植物蛋白质来 源、谷类等，并将它们混合在一起。然后，添加含水或液体成分并与干燥 混合物混合，所述成分包括脂肪、油、动物蛋白质来源、水等。然后，将 混合物加工成粗粒或类似的干燥小片。通常使用挤出工艺形成粗粒，在所 述工艺中，干燥和潮湿成分的混合物在高压和高温下经过机械作用，从小 的开口压出，并被旋转刀片切割成粗粒。然后，干燥湿的粗粒，任选的用 一种或多种局部包衣包被，包括风味剂、脂肪、油、粉末等。还可以不使 用挤出，而使用烘焙工艺从生面团制备粗粒，其中在干燥加热处理前，将 生面团放入模具中。

可以在其常规制备流程中，将非复制型益生微生物添加到宠物食物组 合物中，如混合、挤出、烘焙等，或优选在挤出后的制备中添加，如通过 喷雾或包被食物的表面。对于干燥食物而言，这是特别理想的，其中通过 在将挤出条切割成粗粒之前，通过喷雾或包被挤出条，使挤出条与非复制 型益生微生物(或包含非复制型益生微生物的溶液)接触，或通过喷雾、 包被或浸泡粗粒本身，使粗粒与非复制型益生微生物(或包含非复制型益 生微生物的溶液)接触。

为了局部应用于食物上，将非复制型益生微生物与有助于在食物组合 物表面应用的载体组合物混合。例如，液体、浆状、轻凝胶或含水固体都 可用作该组合物的化合物的载体。使用标准的喷雾或浸泡装置，将化合物 应用于食物组合物的表面。这类载体的实例是用蛋白酶与氨基酸、还原糖 和硫胺联合处理过的切碎的动物副产品。然后，将载体与非复制型益生微 生物混合，并包被在粗粒上，从而制备口味非常好且可接受的干燥食物。 在某些优选的实施方案中，可以简单的混合非复制型益生微生物与商业化 的液体口味增强剂或其他风味组合物，产生可以局部施用于组合物的新的 风味剂(flavor palatant)。与本发明的非复制型益生微生物一起使用的合适 的商业液体口味增强剂包括任何已知的或可以从本领域技术人员已知的宠 物食物口味增强剂或其他风味剂供应商商业获得的可商购的液体口味增强 剂。

本发明的组合物(特别是食物)可以使用常规的宠物食物方法，制备 成罐装的或湿形式。在一个实施方案中，将地面动物(例如，哺乳动物、 禽类、鱼类和/或海产品)的蛋白质类组织与其他成分混合，包括鱼油、谷 粒、其他营养平衡成分、特殊用途的添加剂(例如，维生素和矿物质混合 物、无机盐、纤维素和甜菜渣、膨胀剂等)。还可以添加足够加工用的水。 通常在适合加热的容器中混合湿形式成分，同时掺入组分。可以使用任何 合适的方式实现混合物加热，如直接蒸汽注射或使用装有热交换器的容器。 在加入最后的成分后，将混合物加热至约50°F至约212°F的温度范围。该 范围外的温度也是可接受的，但在不使用其他加工辅助的条件下是商业上 不实际的。当加热至恰当温度时，材料通常是粘稠的液体形式。将粘稠的 液体装罐。加盖，密封容器。然后，将封闭的罐头放入设计用于内容物灭 菌的常规设备中。一般通过加热至大于约230°F的温度下恰当的时间来实 现，取决于使用的温度和组合物。

对于湿食物，非复制型益生微生物可以与载体一起掺入到湿食物组合 物中，所述载体如醇类组合物(即，丙二醇或二丙二醇)、环糊精、麦芽 糊精或淀粉。可选的，可以在形成湿食物组合物前，将非复制型益生微生 物混合到干燥材料中。

可以通过与上文关于干燥食物相似的挤出或烘焙工艺制备本发明的零 食。也可以使用其他工艺在现有的零食形式外部包被风味组合物，或将风 味组合物注射到现有的零食形式内。

本发明的动物玩具通常是通过用其中混合了非复制型益生微生物的风 味组合物包被任何现有玩具来制备的。

本发明的宠物食物组合物中的非复制型益生微生物的量相当于约106至1012cfu/份。

显而易见的，非复制型微生物不形成菌落，因此，该术语可理解为从 104至1012cfu/g复制型细菌获得的非复制型微生物的量。包括失活的、无 活力或死亡的、或作为片段存在的微生物，所述片段如DNA或细胞壁或 细胞质化合物。换言之，组合物中包含的微生物的量表示为如果所有的微 生物存活时，所述量的微生物的菌落形成能力(cfu)，而不论上述微生物 实际上是否是非复制型的，如失活的或死亡的、片段化的、或任意或所有 上述状态的混合物。

宠物食物组合物还可包含益生元。

“益生元”意指在肠中促进益生菌生长的食物物质。它们在摄入它们 的人的胃和/或肠上部中不被分解或在胃肠道中不被吸收，但它们被胃肠微 生物群和/或益生菌发酵。益生元定义在例如Glenn R.Gibson和Marcel B. Roberfroid，Dietary Modulation of the Human Colonic Microbiota： Introducing the Concept of Prebiotics，J.Nutr.1995125：1401-1412中。

根据本发明可使用的益生元没有特别限制，包括在肠中促进益生菌生 长的所有食物物质。优选的，它们可选自低聚糖，其任选包含果糖、半乳 糖、甘露糖；膳食纤维，特别是可溶纤维、大豆纤维；菊粉；或其混合物。 优选的益生元为低聚果糖(FOS)、低聚半乳糖(galacto-oligosaccharides) (IOS)、低聚异麦芽糖、低聚木糖、大豆低聚糖、葡糖基蔗糖(GS)、乳蔗糖 (LS)、乳果糖(LA)、低聚异麦芽酮糖(PAO)、低聚麦芽糖(MOS)、树胶和/ 或其水解产物、果胶和/或其水解产物。

益生元的典型实例为低聚果糖和菊粉。

根据本发明的宠物食物组合物中的益生元的量取决于它们促进乳酸菌 生长的能力。一般而言，组合物可含有0.1至20％的此类益生元(按相对 于干物质含量的重量计)。

宠物食物组合物例如可包含相当于至少103cfu/g益生元、优选104至 107cfu/g益生元的量的非复制型益生菌的量。

本发明人惊奇地发现，例如，在免疫增强作用方面和/或在抗炎作用方 面，非复制型益生微生物甚至可比复制型益生微生物更有效。

这是令人惊奇的，因为益生菌经常被定义为“当以足够的量施用时赋予 宿主健康益处的活的微生物”(FAO/WHO指南)。绝大多数公开的文献涉及 活益生菌。此外，若干研究调查了由非复制型细菌递送的健康益处，它们 中多数表明了益生菌的失活(例如，通过热处理)导致它们的声称的健康益 处的损失(Rachmilewitz，D.等人，2004，Gastroenterology126：520-528； Castagliuolo等人，2005，FEMS Immunol.Med.Microbiol.43：197-204；Gill， H.S.和K.J.Rutherfurd，2001，Br.J.Nutr.86：285-289；Kaila，M.等人， 1995，Arch.Dis.Child72：51-53.)。一些研究显示了灭活的益生菌可保留一些 健康作用(Rachmilewitz，D.等人，2004，Gastroenterology126：520-528； Gill，H.S.和K.J.Rutherfurd，2001，Br.J.Nutr.86：285-289)，但明确的 是，本领域迄今认为活益生菌为更有效的。

“非复制型”益生微生物包括已被热处理的益生细菌。这包括失活的、 死亡的、无活力的和/或以片段例如DNA、代谢物、细胞质复合物、和/或 细胞壁物质存在的微生物。

“非复制型”意指没有活细胞和/或菌落形成单位能够由经典的平板培 养法检出。此类经典的平板培养法总结于微生物学书：James Monroe Jay， Martin J.Loessner，David A.Golden.2005.Modern food microbiology.第 7版，Springer Science，New York，N.Y.790p中。典型地，可如下表明不存 在活细胞：在用不同浓度的细菌制备物(“非复制型”样品)接种和在适当条 件(需氧和/或厌氧气氛下至少24小时)温育之后，在琼脂平板上没有可见的 菌落或液体生长培养基中浊度不增加。

对于本发明的目的，益生菌定义为“对宿主的健康或安康具有有益作用 的微生物细胞制备物或微生物细胞的组分”(Salminen S，Ouwehand A. Benno Y.等人“Probiotics：how should they be defined”Trends Food Sci. Technol.1999：10107-10)。

本发明的组合物可包含足以至少部分地产生健康益处的量的益生微生 物和/或非复制型益生微生物。足以实现所述的量被定义为“治疗有效剂 量”。对该目的有效的量将取决于本领域技术人员所知的许多因素例如动物 的重量和一般健康状态，并取决于食物基质(matrix)的影响。

在预防性应用中，以足以至少部分降低患病风险的量对易患病或有患 病风险的消费者施用根据本发明的组合物。此类量被定义为“预防有效剂 量”。再一次，准确的量取决于许多因素例如动物的健康状态和重量，并取 决于食物基质的影响。

本领域技术人员能够适当地调整治疗有效剂量和/或预防有效剂量。

一般来说，本发明的组合物含有治疗有效剂量和/或预防有效剂量的非 复制型益生微生物。

例如，治疗有效剂量和/或预防有效剂量可以在每日剂量约0.005mg -1000mg非复制型益生微生物的范围内。

非复制型微生物可以相当于104至109cfu/g干组合物的量存在，更优 选以相当于105至109cfu/g干组合物的量存在

可通过本领域已知的任何方法使益生菌成为非复制型的。

当今可用的使得益生菌菌株成为非复制型的技术通常为热处理、γ-辐 射、UV线或使用化学试剂(福尔马林，多聚甲醛)。

就数量而言，例如，“短时间高温”处理的非复制型微生物可以以相当 于104至1012当量cfu/g干组合物的量存在于组合物中。

优选地，使用在食品工业的工业环境下相对容易应用的致使益生菌成 为非复制型的技术。

当今市场上的多数含有益生菌的产品在它们的生产过程中被热处理。 因此，能够与生产的产品一起或至少以相似的方式热处理益生菌，同时益 生菌保持或提高它们的有益的性质或甚至获得对消费者的新的有益性质， 将是方便的。

但是，在文献中，通过热处理的益生微生物失活通常与益生菌活性的 至少部分丧失相关联。

本发明人现在惊奇地发现，例如，通过热处理使得益生微生物成为非 复制型不导致益生菌健康益处的丧失，相反地，可增强现存的健康益处， 并且甚至产生新的健康益处。

因此，本发明的一个实施方案是宠物食物组合物，其中非复制型益生 微生物通过热处理成为非复制型的。

可在至少71.5℃处理至少1秒来进行此热处理。

可使用长时热处理或短时热处理。

在当今工业规模中，通常优选短时热处理，例如UHT-样热处理。这 类热处理减少细菌负载，并且减少加工时间，从而减少营养物质的破坏。

本发明人首次证实，不管它们的初始性质，被高温短时间热处理的益 生微生物表现了抗炎免疫谱(profile)。特别地通过这种热处理发展新的抗炎 谱或加强现有的抗炎谱。

因此通过使用特定的热处理参数，现在可能产生具有抗炎谱的非复制 型益生微生物，即使活的对应物不是抗炎菌株，所述热处理参数对应于典 型的工业可应用的热处理。

因此，例如，热处理可为在约71.5-150℃、约1-120秒的高温处理。 高温处理可为高温/短时(HTST)处理或超高温(UHT)处理。

益生微生物可在约71.5-150℃高温处理约1-120秒的短时间。

更为优选地，所述微生物可在约90-140℃例如90-120℃高温处理约 1-30秒的短时间。

此高温处理使得微生物至少部分成为非复制型的。

可在正常大气压力但也可在高压力下进行高温处理。典型的压力范围 是1至50巴，优选1至10巴，更优选2至5巴。明显地，当加热时，优 选在为液体或固体的介质中热处理益生菌。因此，应用的理想的压力将取 决于提供微生物的组合物的性质和使用的温度。

高温处理可在约71.5-150℃、优选约90-120℃、更优选约120-140℃ 的温度范围内进行。

高温处理可进行约1-120秒、优选约1-30秒、更优选约5-15秒的短时 间。

该给定的时间范围指益生微生物在给定的温度下的时间。需注意的是， 取决于提供微生物的组合物的性质和量以及取决于使用的加热装置的构 造，热施用的时间可不同。

然而，典型地，本发明的组合物和/或微生物通过高温短时(HTST)处 理、巴氏瞬间灭菌法或超高温(UHT)处理来进行处理。

UHT处理是超高温加工或超热处理(两者都缩写为UHT)，涉及通过大 约1-10秒、温度超过135℃(275°F)短时加热的组合物的至少部分灭菌， 所述温度是杀死奶中的细菌芽孢所需要的温度。例如，使用超过135℃温 度用这种方法加工奶使得在必要持续时间内(至2-5秒)降低细菌负载，使能 够连续流操作。

有两种主要类型的UHT系统：直接和间接系统。在直接系统中，通 过蒸汽注射或蒸汽输注处理产品，而在间接系统中，使用平板热交换器、 管状热交换器或刮面热交换器热处理产品。可在产品制备方法中的任一步 骤或多个步骤中应用UHT系统的组合。

HTST处理如下定义(高温/短时)：巴氏灭菌法设计达到5-log减少，杀 死在奶中活的微生物数量的99.9999％。这被认为足以破坏几乎全部酵母、 霉菌和常见的腐败细菌，并且也保证常见病原性热抗性生物的足够的破坏。 在HTST方法中，加热奶至71.7℃(161°F)达15-20秒。

巴氏瞬间灭菌法是易腐的饮料(如水果和蔬菜汁、啤酒和乳制品)的热 巴氏灭菌的方法。它在装入容器前完成，以杀死腐败微生物，以使得产品 更安全以及延长它们的贮存期限。液体在71.5℃(160°F)至74℃(165°F) 温度处理约15到30秒的同时以受控制的连续流移动。

对于本发明的目的，术语“短时高温处理”应包括例如高温短时(HTST) 处理、UHT处理和巴氏瞬间灭菌法。

由于此类热处理提供了具有改善的抗炎谱的非复制型益生菌；本发明 的组合物可用于炎性疾病的预防或治疗。

不特别限制能够通过本发明的组合物治疗或预防的炎性疾病。例如， 它们可选自急性炎症例如脓毒病；灼伤；和慢性炎症，例如炎性肠病，例 如，克罗恩病、溃疡性结肠炎、隐窝炎(pouchitis)；坏死性小肠结肠炎；皮 肤炎症，例如UV或化学诱导的皮肤炎症、湿疹、反应性皮肤；肠易激综 合征；眼炎症；变态反应、哮喘；和它们的组合。

如果使用长时热处理使得益生微生物成为非复制型，可在约70-150 ℃温度范围内达约3分钟-2小时，优选地在80-140℃范围内从5分钟-40 分钟进行此类热处理。

尽管现有技术通常教导通过长时热处理变成非复制型的细菌通常就发 挥它们的益生性质而言不如活细胞有效，但是本发明人能够证实与它们的 活对应物相比被长时热处理的益生菌在刺激免疫系统中是优越的。

本发明也涉及包含益生微生物的组合物，所述微生物通过在至少约70 ℃、至少约3分钟的热处理成为非复制型的。

通过体外免疫谱分析(immuneprofiling)确认非复制型益生菌的免疫增 强作用。使用的体外模型使用来自人外周血单核细胞(PBMC)的细胞因子 谱分析并且作为测试免疫调节化合物的标准模型在本领域中被广为接受 (Schultz等人，2003，Journal of Dairy Research70，165-173；Taylor等人， 2006，Clinical and Experimental Allergy，36，1227-1235；Kekkonen等人， 2008，World Journal of Gastroenterology，14，1192-1203)。

若干作者/研究队伍已经使用了体外PBMC测定法，以例如根据益生 菌的免疫谱，即它们的抗或促炎特征对它们分类(Kekkonen等人，2008， World Journal of Gastroenterology，14，1192-1203)。例如，在结肠炎小鼠 模型中已经显示出此测定法允许预测益生候选物的抗炎作用(Foligne，B.， 等人，2007，World J.Gastroenterol.13：236-243)。此外，在临床试验中此测 定法被经常地用作读出(read-out)测定法并且显示了此测定法导致与临床 结果一致的结果(Schultz等人，2003，Journal of Dairy Research70，165- 173；Taylor等人，2006，Clinical and Experimental Allergy，36，1227-1235)。

在过去的几十年中变态反应性疾病稳定地上升并且当前WHO认为它 们是流行病。一般地，认为变态反应由免疫系统的Th1和Th2应答的不平 衡造成，所述不平衡导致强烈偏向于Th2介质的生产。因此，通过恢复免 疫系统的Th1分路和Th2分路之间的适当的平衡能够缓和、下调或预防变 态反应。这暗示了减少Th2应答或至少瞬时增强Th1应答的必要性。后者 将是免疫增强应答的特征，通常由例如较高水平的IFNγ、TNF-α和IL-12 伴随。(Kekkonen等人，2008，World Journal of Gastroenterology，14， 1192-1203；Viljanen M.等人，2005，Allergy，60，494-500)。

本发明的宠物食物组合物因而允许其治疗或预防与受损的免疫防御相 关的疾病。

因此，不特别限制能够通过本发明组合物治疗或预防的与受损的免疫 防御相关的疾病。

例如，它们可选自感染，特别地为细菌的、病毒的、真菌的和/或寄生 虫感染；吞噬细胞缺乏；低的到严重的免疫抑制水平例如由应激或免疫抑 制药物、化学疗法或放射疗法诱导的那些免疫抑制水平；较少免疫活性的 免疫系统的天然状态，例如新生儿的那些免疫系统；变态反应；以及其组 合。

本发明描述的宠物食物组合物也允许其增强动物对疫苗的应答，特别 是对口服疫苗的应答。

任何量的非复制型微生物将会是有效力的。然而，一般优选，如果至 少90％，优选至少95％，更优选至少98％，最优选至少99％，理想地至 少99.9％，最理想地全部益生菌为非复制型的。

在本发明的一个实施方案中全部微生物为非复制型的。

因此，在本发明的组合物中至少90％，优选地至少95％，更优选地至 少98％，最优选地至少99％，理想地至少99.9％，最理想地全部益生菌可 为非复制型的。

所有益生微生物可用于本发明的目的。

例如，益生微生物可选自双歧杆菌属(bifidobacteria)、乳杆菌属 (lactobacilli)、丙酸杆菌属(propionibacteria)，或其组合，例如长双歧杆菌 (Bifidobacterium longum)、乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、动物双歧杆 菌(Bifidobacterium animalis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双 歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium  adolescentis)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、干酪乳杆菌 (Lactobacillus casei)、类干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)、唾液乳杆菌 (Lactobacillus salivarius)、路氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、鼠李糖乳杆 菌(Lactobacillus rhamnosus)、约汉逊氏乳杆菌(Lactobacillus iohnsonii)、植 物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)、 乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、双乙酰乳酸乳球菌(Lactococcus  diacetylactis)、乳脂乳球菌(Lactococcus cremoris)、保加利亚乳杆菌 (Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆 菌(Lactobacillus delbrueckii)、大肠杆菌(Escherichia coli)和/或它们的混合 物。

根据本发明的组合物可包含例如选自长双歧杆菌NCC3001、长双歧 杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818、约汉逊 氏乳杆菌La1、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC4007、路氏 乳杆菌DSM17938、路氏乳杆菌ATCC55730、嗜热链球菌NCC2019、嗜 热链球菌NCC2059、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干 酪乳杆菌ACA-DC6002(NCC1825)、大肠杆菌Nissle、保加利亚乳杆菌 NCC15、乳酸乳球菌NCC2287，或它们的组合的益生微生物。

所有这些菌株根据布达佩斯条约保藏和/或是可商购的。

根据布达佩斯条约保藏的菌株如下：

长双歧杆菌NCC3001：ATCC BAA-999

长双歧杆菌NCC2705：CNCM I-2618

短双歧杆菌NCC2950 CNCM I-3865

乳双歧杆菌NCC2818：CNCM I-3446

类干酪乳杆菌NCC2461：CNCM I-2116

鼠李糖乳杆菌NCC4007：CGMCC1.3724

嗜热链球菌NCC2019：CNCM I-1422

嗜热链球菌NCC2059：CNCM I-4153

乳酸乳球菌NCC2287：CNCM I-4154

干酪乳杆菌NCC4006：CNCM I-1518

干酪乳杆菌NCC1825：ACA-DC6002

嗜酸乳杆菌NCC3009：ATCC700396

保加利亚乳杆菌NCC15：CNCM I-1198

约汉逊氏乳杆菌La1 CNCM I-1225

路氏乳杆菌DSM17938 DSM17938

路氏乳杆菌ATCC55730 ATCC55730

大肠杆菌Nissle1917：DSM6601

以ATCC命名的菌株保藏于ATCC Patent Depository，10801 University Blvd.，Manassas，VA20110，USA。

以CNCM命名的菌株保藏于国立微生物保藏中心(CNCM)，25， ROUX博士路，F-75724巴黎，15区，法国(COLLECTION NATIONALE  DE CULTURES DE MICROORGANISMES(CNCM)，25rue du Docteur  Roux，F-75724PARIS Cedex15，France)。

以CGMCC命名的菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，微 生物研究所，中国科学院，中关村，P.O.Box2714，北京100080，中国。

以ACA-DC命名的菌株保藏于Greek Coordinated Collections of  Microorganisms，Dairy Laboratory，Department of Food Science and  Technology，Agricultural University of Athens，75，Iera odos，Botanikos， Athens，11855，希腊。

以DSM命名的菌株保藏于DSMZ-Deutsche Sammlung von  Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，Inhoffenstr.7B^，38124 Braunschweig，德国。

本领域技术人员将理解他们能够自由地组合文中描述的本发明的全部 特征而不偏离本发明公开的范围。

本发明另外的优势和特点从下述实施例和图中显而易见。

图1A和B显示了用“短时高温”处理的益生菌的抗炎免疫谱(profiles) 的增强。

图2显示了非抗炎益生菌菌株变为抗炎的，即非抗炎益生菌菌株在用 “短时高温”处理后表现出显著的体外抗炎免疫谱。

图3A和B显示了在可商购的产品中使用的益生菌菌株，其在用“短 时高温”处理之后表现出增强的或新的体外抗炎免疫谱。

图4A和B显示了乳品起子菌株(即Lc1起子菌株)，经高温热处理所 述起子菌株表现出增强的或新的体外抗炎免疫谱。

图5显示了非抗炎益生菌菌株，在被HTST处理之后其表现出体外抗 炎免疫谱。

图6：用以它们活的和热处理(140℃、15秒)形式的益生和乳品起子菌 株生成的PBMC数据的主成分分析(IL-12p40、IFN-γ、TNF-α、IL-10)。 每一个点代表用NCC数字或名称标识的活的或热处理的一种菌株。

图7显示了活的和热处理的(85℃，20分钟)菌株的IL-12p40/IL-10比 率。总体地，在85℃达20分钟的热处理导致IL-12p40/IL-10比率上升， 与本发明的“短时高温”处理相反(图1、2、3、4、和5)。

图8显示了来自用热处理的细菌刺激的人PBMCs的体外细胞因子分 泌的增强。

图9显示了在受盐水攻击的OVA致敏的小鼠中(阴性对照)、在受OVA 攻击的OVA致敏的小鼠中(阳性对照)和在受OVA攻击以及用热处理的或 活的短双歧杆菌NCC2950处理的OVA致敏的小鼠中观测到的腹泻强度百 分数。以腹泻强度百分数展示结果(从4个独立实验中计算平均值±SEM)， 100％腹泻强度对应于在阳性对照(由变态反应原致敏和攻击)组中出现的 症状。

实施例1：

方法学：

细菌制备物

通常认为活的益生菌对宿主免疫系统递送的健康益处是菌株特异性 的。已经显示诱导高水平的IL-10和/或体外诱导低水平的促炎细胞因子 (PBMC测定法)的益生菌是有效的体内抗炎菌株(Foligné，B.等人，2007， World J.Gastroenterol.13：236-243)。

使用若干益生菌菌株以研究热处理的益生菌的抗炎性质。这些菌株为 长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短双歧杆菌NCC2950、 乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007、干酪乳杆菌NCC4006、嗜酸乳杆菌NCC3009、干酪乳杆菌 ACA-DC6002(NCC1825)和大肠杆菌Nissle。也测试了包括商业用于生产 Nestlé Lc1发酵产物的一些菌株在内的若干起子培养物菌株：嗜热链球菌 NCC2019、嗜热链球菌NCC2059、保加利亚乳杆菌NCC15和乳酸乳球 菌NCC2287。

在对每一菌株优化的条件下在5-15L的生物反应器中培养细菌细胞。 全部的典型细菌生长培养基为可用的。此类培养基为本领域技术人员所知。 当调整pH至5.5时，连续地加入30％碱溶液(NaOH或Ca(OH)2)。当足 够时，通过用CO2充气顶部空间维持厌氧的条件。在标准需氧条件下培养 大肠杆菌。

通过离心(5000xg，4℃)收集细菌细胞并且重悬于足够体积的磷酸盐 缓冲液(PBS)中以达到约109-1010cfu/ml的最终浓度。一部分制备物与15％ 甘油冷冻在-80℃。通过以下方法热处理另一部分细胞：

-超高温：140℃达15秒；通过间接蒸汽注射。

-高温短时(HTST)：通过间接蒸汽注射74℃、90℃和120℃处理15 秒。

-在水浴中长时间低温度(85℃，20分钟)

热处理后，在-80℃冻存样品直到使用。

细菌制备物的体外免疫谱分析：

评价活的和热处理的细菌制备物的免疫谱(即从体外人血细胞诱导特 定细胞因子分泌的能力)。从血液过滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。 在通过细胞密度梯度分离之后，收集单核细胞并用Hank平衡盐溶液洗涤 两次。随后在用10％胎牛血清(Bioconcept，Paris，法国)、1％L-谷氨酰胺 (Sigma)、1％青霉素/链霉素(Sigma)和0.1％庆大霉素补充的Iscove改良 的Dulbecco培养基(IMDM，Sigma)中重悬细胞。随后在48孔板中用活的 和热处理的细菌(相当于7x106cfu/孔)温育PBMC(7x105个细胞/孔)达36小 时。在来自8个个体供体的PBMC上测试活的和热处理的细菌的作用，所 述个体供体被分至两个分离的实验。在温育36小时之后，冷冻并在-20℃ 保存培养板直到细胞因子测量。对活细菌和它们热处理的对应物平行地实 施(即，在同一实验中对同一批PBMC实施)细胞因子谱分析。

在36小时温育后依照制造者的说明书通过ELISA(R&D DuoSet  Human IL-10、BD OptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNFα、BD OptEIA 人IFN-γ)确定在细胞培养物上清液中的细胞因子(IFN-γ、IL-12p40、TNF-α 和IL-10)的水平。IFN-γ、IL-12p40、和TNF-α是促炎细胞因子，而IL-10 是强效的抗炎介质。用4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM表示结果， 并且结果代表了两个单独实验，每一个所述单独实验用4个供体实施。对 每一菌株计算IL-12p40/IL-10的比率作为体内抗炎作用的预测值(Foligné， B.，等人，2007，World J.Gastroenterol.13：236-243)。

把对每一菌株通过ELISA(见上)确定的细胞因子数值(pg/ml)转移入 BioNumerics v5.10软件(Applied Maths，Sint-Martens-Latem，比利时)。在 此数据集上实施主成分分析(PCA，量度技术)。此分析包括就特征减去平均 值和就特征除以方差。

结果

通过超高温(UHT)/高温短时(HTST)样处理生成的抗炎谱

将研究中的益生菌菌株进行一系列热处理(超高温(UHT)、高温短时 (HTST)和85℃达20分钟)并且把它们的免疫谱和体外活细胞的那些免疫谱 相比较。当与人PBMC一起温育时活微生物(益生菌和/或乳品起子培养物) 诱导了不同水平的细胞因子产生(图1、2、3、4和5)。这些微生物的热处 理以温度依赖性的方式改变了由PBMC生产的细胞因子的水平。“短时高 温”处理(120℃或140℃，15秒)产生了具有抗炎免疫谱的非复制型细菌(图 1、2、3和4)。实际上，UHT-样处理的菌株(140℃，15秒)诱导了更少的 促炎细胞因子(TNF-α，IFN-γ，IL-12p40)，同时维持或诱导额外的IL-10产 生(与活的对应物相比)。对于任何UHT-样处理的菌株，获得的IL-12p40/ IL-10比率与活细胞相比更低(图1、2、3和4)。对于由HTST-样处理处理 的细菌，即受到120℃持续15秒(图1、2、3和4)、或74℃和90℃持续 15秒(图5)处理的细菌，这一观察结果也是有效的。热处理(UHT-样或 HTST-样处理)对益生菌菌株(图1、2、3和5)和乳品起子培养物(图4)的体 外免疫谱具有相似的效果。对用活的和热处理的(140℃，15秒)益生菌和乳 品起子菌株生成的PBMC数据的主成分分析揭示了活的菌株全部沿x轴分 散，表明菌株表现出非常不同的体外免疫谱，从低(左侧)促炎细胞因子的 诱导物到高(右侧)促炎细胞因子的诱导物。热处理的菌株聚集在图表左侧， 显示了热处理菌株更少诱导促炎细胞因子(图6)。与之相反，在85℃达20 分钟的热处理的细菌比活细胞诱导更多的促炎细胞因子和更少的IL-10， 导致更高的IL-12p40/IL-10比率(图7)。

UHT-样和HTST-样处理增强或生成抗炎谱。

不管它们各自初始的免疫谱(活细胞)，UHT和HTST处理的菌株表现 出抗炎谱。已表明，在“短时高温”处理以后，已知为体内抗炎且体外表现 抗炎谱的益生菌菌株(长双歧杆菌NCC3001、长双歧杆菌NCC2705、短 双歧杆菌NCC2950、乳双歧杆菌NCC2818)表现出增强的体外抗炎谱。 如图1中所示，UHT-样处理的双歧杆菌属菌株的IL-12p40/IL-10比率低 于来自活的对应物的那些比率，因此显示了UHT-样处理的样品的提高的 抗炎谱。更突出地，对于非抗炎的活菌株也确认了由HUT-样和HTST-样 处理产生抗炎谱。活鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461 都表现出体外高IL-12p40/IL-10比率(图2和5)。显示了这两种活菌株对 小鼠中TNBS-诱导的结肠炎是非保护性的。在“短时高温”处理(UHT或 HTST)以后，由鼠李糖乳杆菌NCC4007和类干酪乳杆菌NCC2461诱导的 IL-12p40/IL-10比率剧烈下降，达到与用双歧杆菌属菌株获得的水平一样 低的水平。这些低IL-12p40/IL-10比率由于与没有变化(鼠李糖乳杆菌 NCC4007)或剧烈诱导(类干酪乳杆菌NCC2461)的IL-10分泌相结合的低 水平IL-12p40产生所致(图2)。

因此：

-通过UHT-样和HTST-样热处理能够增强活微生物的抗炎谱(例如长 双歧杆菌NCC2705、长双歧杆菌NCC3001、短双歧杆菌NCC2950、乳 双歧杆菌NCC2818)。

-通过UHT-样和HTST-样热处理能够从非抗炎活微生物产生抗炎谱 (例如鼠李糖乳杆菌NCC4007、类干酪乳杆菌NCC2461、乳品起子嗜热链 球菌NCC2019)。

-对于从可商购的产品(包含益生大肠杆菌菌株)分离的菌株也显示了 抗炎谱(图3A&B)。

对于所有测试的益生菌和乳品起子例如乳杆菌、双歧杆菌和链球菌， UHT/HTST-样处理的影响是相似的。

将UHT/HTST-样处理施用于表现出不同体外免疫谱的若干乳杆菌、 双歧杆菌和链球菌。与它们活的对应物相比，在UHT/HTST-样处理以后 所有菌株诱导更少的促炎细胞因子(图1、2、3、4、5和6)，这证实了 UHT/HTST-样处理对获得的非复制型细菌的免疫性质的作用能够概括至 全部益生菌，特别是概括至乳杆菌属和双歧杆菌属和特定的大肠杆菌株以 及概括至全部乳品起子培养物，特别是概括至链球菌属、乳球菌属和乳杆 菌属。

实施例2：

方法学：

细菌制备物：

使用5株益生菌菌株以研究非复制型益生菌的免疫增强性质：3株双 歧杆菌(长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、短双歧杆菌 NCC2950)和2株乳杆菌(类干酪乳杆菌NCC2461、鼠李糖乳杆菌NCC 4007)。

在37℃、无pH控制下以分批发酵使细菌细胞在MRS上生长达16-18 小时。把细菌细胞离心下来(5,000xg，4℃)并重悬于磷酸盐缓冲液中，然 后在盐水中稀释，以达到约10E10cfu/ml的最终浓度。在水浴中在85℃将 长双歧杆菌NCC3001、乳双歧杆菌NCC2818、类干酪乳杆菌NCC2461、 鼠李糖乳杆菌NCC4007热处理20分钟。在水浴中在90℃将短双歧杆菌 NCC2950热处理30分钟。将热处理的细菌悬液等分(aliquoted)并冻存于-80 ℃直到使用。活细菌贮存在-80℃、15％PBS-甘油中直到使用。

细菌制备物的体外免疫谱分析

评价活的和热处理的细菌制备物的免疫谱(即体外诱导人血细胞特定 细胞因子分泌的能力)。从血液过滤器分离人外周血单核细胞(PBMCs)。在 通过细胞密度梯度分离之后，收集单核细胞并用Hank平衡盐溶液洗涤两 次。随后在用10％胎牛血清(Bioconcept，Paris，法国)、1％L-谷氨酰胺 (Sigma)、1％青霉素/链霉素(Sigma)和0.1％庆大霉素补充的Iscove改良 的Dulbecco培养基(IMDM，Sigma)中重悬细胞。随后在48孔板中用活的 和热处理的细菌(相当于7x106cfu/孔)温育PBMC(7x105个细胞/孔)达36小 时。在来自8个个体供体的PBMC上测试活的和热处理的细菌的作用，所 述个体供体被分至两个分离的实验。在温育36小时之后，冷冻并在-20℃ 保存培养板直到细胞因子测量。对活细菌和它们热处理的对应物平行地实 施(即，在同一实验中对同一批PBMC实施)细胞因子谱分析。

在36小时温育后依照制造者的说明书通过ELISA(R&D DuoSet  Human IL-10、BD OptEIA人IL12p40、BD OptEIA人TNF、BD OptEIA 人IFN-γ)确定在细胞培养物上清液中的细胞因子(IFN-γ、IL-12p40、TNF-α 和IL-10)的水平。IFN-γ、IL-12p40、TNF-α是促炎细胞因子，而IL-10是 强效的抗炎介质。用4个个体供体的平均值(pg/ml)+/-SEM表示结果，并 且结果代表了两个单独实验，每一个所述单独实验用4个供体实施。

活的和热处理的短双歧杆菌NCC2950在预防变态反应性腹泻中的体 内作用

使用变态反应性腹泻的小鼠模型以测试短双歧杆菌NCC2950的Th1 促进作用(Brandt E.B等人.JCI2003；112(11)：1666-1667)。在致敏(间隔14 天，在第0和第14天2次腹膜内注射卵清蛋白(OVA)和硫酸铝钾)之后， 用OVA口服攻击雄性Balb/c小鼠6次(第27、29、32、34、36、39天)， 导致瞬时的临床症状(腹泻)和免疫参数(总IgE、OVA特异性的IgE、小鼠 肥大细胞蛋白质酶1即MMCP-1的血浆浓度)的改变。在OVA致敏之前 四天(第-3、-2、-1、0天和第11、12、13和14天)和在攻击期间(第23至 39天)通过管饲法施用活的或在90℃热处理30分钟的短双歧杆菌 NCC2950。使用约109菌落形成单位(cfu)或相当的cfu/小鼠的日细菌剂量。

结果

热处理后“促炎”细胞因子分泌的诱导

体外评估热处理的细菌菌株刺激人外周血单核细胞(PBMC)分泌细胞 因子的能力。在相同的体外测定法中将经热处理的细菌刺激PBMC的基于 4种细胞因子的免疫谱与活细菌细胞诱导的基于4种细胞因子的免疫谱相 比较。

将热处理的制备物平板接种并评估活菌数的缺乏。热处理的细菌制备 物在平板接种后不产生菌落。

当与人PBMC一起温育时活的益生菌诱导不同的和菌株依赖性水平 的细胞因子产生(图8)。与它们的活的对应物相比，益生菌的热处理改变了 PBMC产生的细胞因子的水平。热处理的细菌比它们的活的对应物诱导更 多的促炎细胞因子(TNF-α、IFN-γ和IL-12p40)。相反，与活细胞对比，热 处理的细菌诱导相似或更低量的IL-10(图8)。这些数据显示了热处理的细 菌比它们的活的对应物更能够刺激免疫系统且因此更能够增强弱化的免疫 防御。换言之，体外数据说明了在热处理之后细菌菌株的提高的免疫增强 效果。

为了说明热处理的短双歧杆菌NCC2950对免疫系统的增强的作用(与 活细胞相比)，在变态反应性腹泻的动物模型中测试活的和热处理的短双歧 杆菌NCC2950(菌株A)。

与阳性对照组相比，在用热处理的短双歧杆菌NCC2950处理后，腹 泻的强度显著地和持续地下降(41.1％±4.8)，而在用活的短双歧杆菌 NCC2950处理后腹泻的强度仅降低了20±28.3％。这些结果显示了热处 理的短双歧杆菌NCC2950表现出比它的活的对应物增强的对变态反应性 腹泻的保护作用(图9)

因此，显示了在热处理后益生菌增强免疫防御的能力被提高了。

其他实施例：

可以使用本专利申请中描述的标准技术制备下列宠物食物组合物：

仅用于接受机构

仅用于国际局

本文标签： 微生物有益食物制品宠物