一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系及其改良方法

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本发明公开了一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系及其改良方法，该改良方法包括：以甘蓝型油菜Ogura?CMS不育系为母本，以甘蓝型油菜Ogura?CMS恢复系为父本，杂交获得F1代种子；对F1代种子进行辐照处理，辐照处理后播种得到F1代植株；以甘蓝型油菜Ogura?CMS不育系为母本，以F1代植株为父本，杂交获得种子，种子播种后得到后代植株；对后代植株中的可育株进行单株分子标记筛选，获得改良型甘蓝型油菜Ogura?CMS恢复系。本发明剔除了外源萝卜染色体片段中几个与恢复基因紧密连锁的分子标记，筛选获得具有更短外源萝卜染色体片段的改良型恢复系，改良型恢复系具有优良农艺形状和更高籽粒产量。

1.一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系，其特征在于，它由以下方式改良：(1)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系为父本，杂交获得F代种子；(2)对F代种子进行辐照处理，辐照处理后将F代种子播种，得到F代植株；(3)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以F代植株为父本，杂交获得种子，将种子播种，得到后代植株；(4)对所述后代植株中的可育株进行单株分子标记筛选；最终获得所述改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系。 2.如权利要求1所述的改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系，其特征在于，步骤(4)中，所述分子标记包括G26；以及BonJon、OPF10或OPN20中的至少一种。 3.一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系的改良方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系为父本，杂交获得F代种子；(2)对F代种子进行辐照处理，辐照处理后将F代种子播种，得到F代植株；(3)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以F代植株为父本，杂交获得种子，将种子播种，得到后代植株；(4)对所述后代植株中的可育株进行单株分子标记筛选，获得所述改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系。 4.如权利要求3所述的改良方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为不育系Fu58Drakkar。 5.如权利要求3所述的改良方法，其特征在于，所述甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系为恢复系R2000。 6.如权利要求3所述的改良方法，其特征在于，步骤(2)中，采用Coγ射线对F1代种子进行均匀辐照，辐照剂量为1200～2600Gy，剂量率为1.2Gy/min。 7.如权利要求3或6所述的改良方法，其特征在于，步骤(2)中，采用Coγ射线对F1代种子进行均匀辐照，辐照剂量为2000Gy，剂量率为1.2Gy/min。 8.如权利要求3所述的改良方法，其特征在于，步骤(4)中，所述分子标记包括G26；以及BonJon、OPF10或OPN20中的至少一种。 9.如权利要求3或8所述的改良方法，其特征在于，所述分子标记筛选包括：分别提取可育株单株的基因组DNA，并以基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，根据扩增结果筛选改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系；其中，第一对引物为：上游引物：5’-GATCCGATTCTTCTCCTGTTG-3’；下游引物：5’-GCCTACTCCTCAAATCACTCT-3’；第二对引物为：上游引物：5’-AACTTTTTGTGTTTGATTTCTTGC-3’；下游引物：5’-ACTCCTTCTAAACAAAACCAAACA-3’；第三对引物为：上游引物：5’-CCTTAGTTTAGTTGTAGGTGGTGG-3’；下游引物：5’-AGAAACCGCTCAATTTTAACATAA-3’；第四对引物为：上游引物：5’-GCTCACCTCATCCATCTTCCTCAG-3’；下游引物：5’-CTCGTCCTTTACCTTCTGTGGTTG-3’。 10.分子标记组合物在筛选改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系中的应用，其特征在于，所述分子标记组合物为G26、BonJon、OPF10和OPN20。

技术领域

本发明属于作物育种技术领域，具体涉及一种改良型甘蓝型油菜萝卜 细胞质雄性不育恢复系及其改良方法。

背景技术

萝卜细胞质雄性不育恢复系(oguracytoplasmicmalesterility，ogura CMS)在1968年首次在萝卜(Raphanussativus)资源中被发现 (OguraH.StudiesonthemalesterilityinJapaneseradishwithspecial referencetotheutilizationofthissterilitytowardsthepracticalraisingof hybridseed[J].MemFacAgricKagoshimaUniv，1968，6:39－78.)，其 不育性稳定彻底，是由细胞质中线粒体嵌合基因Orf138(BrownGG， FormanovaN，JinH，etalTheradishRforestorergeneofOguracytoplasmic malesterilityencodesaproteinwithultiplepentatricopeptiderepeats [J].PlantJ，2003，35(2):262－272.；DesloireS，GherbiH，LalouiW， etal.Identificationofthefertilityrestorationlocus，Rfo，inradish，asame memberofthepentatricopeptide-repeatproteinfamily[J].EMBORep， 2003，4(6):588－594.)和一对隐性细胞核基因(rfrf)共同控制 (BonhommeS，BudarF，LancelinD，etal.Sequenceandtranscriptanalysis oftheNco2.5Ogura-specificfragmentorrelatedwithcytoplasmicmale sterilityinBrassicahybrids[J].MolGenGenet，1992，235(2):340－348.) 的。

因为所有甘蓝型油菜品种均可以很好地保持其不育性，所以被认为是 转育高产、高含油量油菜不育系的首选途径。但由于油菜品种中不存在 OguraCMS系的恢复源，所以油菜萝卜质雄性不育三系利用的主要任务是 选育甘蓝型油菜OguraCMS的恢复系。

然而，研究(GiancolaS,MarhadourS,DesloireS,etal.Characterization ofaradishintrogressioncarryingtheOgurafertilityrestorergeneRfoin rapeseed，usingtheArabidopsisgenomesequenceandradishgenetic mapping[J].TheorApplGenet，2003，107(8):1442－1451.)表明，把 恢复基因导入油菜的同时也导致了恢复系农艺性状不良和籽粒硫代含量 的增加，并且利用各种传统育种技术很难有效降低后代植株籽粒的硫甙含 量(文雁成，张书芬，王建平，等.甘蓝型油菜萝卜质雄性不育恢复系 的筛选和初步研究[J].华北农学报，2010，25(4):102－106.)，法国 INRA(1987)报道了将带有恢复基因的萝卜染色体片段导入到了油菜中，利 用γ射线诱变获得了低硫甙含量的OguraCMS恢复系R2000，并且由其 研究出的用于甘蓝型油菜萝卜质不育双低恢复系选育的PCR标记也取得 了较好的效果。随后，各国研究者开展了对OguraCMS恢复系的改良和 相关遗传研究。通过遗传定位、测序等方法，已有许多报道关于导入油菜 的带有恢复基因的萝卜染色体片段的核酸信息。因此，至今已经获得了部 分与这些关键恢复基因紧密连锁的分子标记。这为开展Ogura恢复系创新 过程中用分子标记作为辅助手段提供了必要条件。

自获得甘蓝型油菜OguraCMS恢复系后，育种家和研究者们开展了 大量的回交和系谱选育，以期获得强恢复力和低硫苷的油菜恢复系材料。 遗憾的是，通过以上方法获得的OguraCMS恢复系并未得到实质性改良。 这是因为常规杂交的遗传基础是染色体重组，其本身所带有的染色体片段 (不利基因)无法剔除。因此，若要打破不利基因(硫苷)的连锁，缩短 萝卜染色体片段需采用其他方法。

采用辐照(物理诱变)的方法，可以随机打断植物细胞中的染色体， 从而创造新材料。基于此原理，将导入油菜中的外源萝卜染色体片段打断， 缩短其长度是可行的。法国INRA的研究者Primar-Brisset等(2005)采用 辐照方法获得了新型恢复系R2000，较以往的恢复系版本有了很大的改 良。然而，恢复系R2000的外源萝卜染色体片段仍然太长，这对其农艺性 状和产量的表现具有很大的影响。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供了一种改良型甘蓝型油菜萝卜 细胞质雄性不育恢复系，该雄性不育恢复系农艺性状优良，为强优势杂交 组合选育提供了基础。同时，本发明另一个所要解决的技术问题在于提供 了一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系的改良方法。

一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系，它由以下方式改 良：

(1)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以甘蓝型油菜萝 卜细胞质雄性不育恢复系为父本，杂交获得F1代种子；

(2)对F1代种子进行辐照处理，辐照处理后将F1代种子播种，得到 F1代植株；

(3)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以F1代植株为父 本，杂交获得种子，将种子播种，得到后代植株；

(4)对所述后代植株中的可育株进行单株分子标记筛选；

最终获得所述改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系。

本发明采用辐照处理和分子标记筛选相结合的方法，剔除了外源萝卜 染色体片段中几个与恢复基因紧密连锁的分子标记，筛选获得外源萝卜染 色体片段比原始恢复系更短的改良型甘蓝型油菜OguraCMS恢复系，有 效解决了原始恢复系杂种优势不强，生育期迟、植株矮小，生长势弱、品 质差等问题。

本发明中，所述甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为不育系 Fu58Drakkar；所述甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系为恢复系 R2000。不育系Fu58Drakkar和恢复系R2000均购自法国INRA(2010年 1月8日，No.1001Li)。

作为优选，步骤(2)中，采用60Coγ射线对F1代种子进行均匀辐照， 辐照剂量为1200～2600Gy，剂量率为1.2Gy/min。

作为进一步优选，步骤(2)中，采用60Co对F1代种子进行均匀辐 照，辐照剂量为2000Gy，剂量率为1.2Gy/min。

作为优选，步骤(4)中，所述分子标记包括G26；以及BonJon、OPF10 或OPN20中的至少一种。其中，G26是基于恢复基因本身的分子标记， 而BonJon、OPF10和OPN20则是与恢复基因紧密连锁的分子标记。在改 良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系中，G26必须存在，它的存在 表明恢复系对OguraCMS不育系仍然具有恢复育性的能力；而BonJon、 OPF10和OPN20则需要被剔除，因其会给恢复系带来不良的农艺性状。

作为优选，所述分子标记筛选包括：分别提取可育株单株的基因组 DNA，并以基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，根据扩增结果 筛选改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系；

其中，第一对引物(用于扩增分子标记BonJon)为：

上游引物：5’-GATCCGATTCTTCTCCTGTTG-3’；

下游引物：5’-GCCTACTCCTCAAATCACTCT-3’；

第二对引物(用于扩增分子标记OPF10)为：

上游引物：5’-AACTTTTTGTGTTTGATTTCTTGC-3’；

下游引物：5’-ACTCCTTCTAAACAAAACCAAACA-3’；

第三对引物(用于扩增分子标记OPF20)为：

上游引物：5’-CCTTAGTTTAGTTGTAGGTGGTGG-3’；

下游引物：5’-AGAAACCGCTCAATTTTAACATAA-3’；

第四对引物(用于扩增分子标记G26)为：

上游引物：5’-GCTCACCTCATCCATCTTCCTCAG-3’；

下游引物：5’-CTCGTCCTTTACCTTCTGTGGTTG-3’。

本发明第三个所要解决的技术问题在于提供了分子标记组合物在筛 选改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系中的应用，所述分子标记 组合物为G26、BonJon、OPF10和OPN20。

作为优选，所述应用包括：

(1)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以甘蓝型油菜萝 卜细胞质雄性不育恢复系为父本，杂交获得F1代种子；

(2)对F1代种子进行辐照处理，辐照处理后将F1代种子播种，得到 F1代植株；

(3)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系为母本，以F1代植株为父 本，杂交获得种子，将种子播种，得到后代植株；

(4)利用上述四对引物对所述后代植株中的可育株进行单株分子标 记筛选，获得所述改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明采用辐照处理和分子标记筛选相结合的方法，在保证恢复系对 OguraCMS不育系具有恢复育性能力的同时，剔除了外源萝卜染色体片段 中三个与恢复基因紧密连锁的分子标记，筛选获得外源萝卜染色体片段比 原始恢复系更短的改良型甘蓝型油菜OguraCMS恢复系，为强优势杂交 组合选育提供了基础。

附图说明

图1为本发明一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系的改 良方法的流程图；

图2为RC947单株与原始恢复系R2000的分子标记筛选结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

实施例1

一种改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系的改良方法，包括 以下步骤(其流程图见图1)：

(1)以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育系Fu58Drakkar(以下简称不 育系Fu58Drakkar)为母本，以甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系 R2000(以下简称恢复系R2000)为父本，杂交获得F1代种子；

本实施例中，为扩大母本和父本的种源，先用保持系G142(为浙江 省农业科学院作物与核技术利用研究所油菜育种组自育材料，后更名为浙 油50)将不育系Fu58Drakkar保持一代，同时恢复系R2000自交一代；再 以不育系Fu58Drakkar或保持系G142保持的不育系Fu58DrakkarBC0(其 与不育系Fu58Drakkar的基因型相同)为母本，与父本恢复系R2000杂交， 获得F1代种子约500g。

(2)对F1代种子进行辐照处理，辐照处理后将F1代种子播种，得到 F1代植株；

以60Co作为辐照源，分别以1000Gy，2000Gy，3000Gy和4000Gy 为辐照剂量，剂量率均为1.2Gy/min。对F1代种子进行辐照处理(室温下 进行)，辐照处理在浙江省农业科学院作物与核技术利用研究所浙江省辐 照中心内完成，以筛选合适的半致死剂量。最终确定的辐照剂量为2000 Gy、剂量率为1.2Gy/min。

(3)以不育系Fu58DrakkarBC0为母本，以F1代植株为父本，杂交 获得种子，将种子播种，得到后代植株；

(4)淘汰后代植株中的不育株，对可育株进行单株分子标记筛选， 获得改良型甘蓝型油菜萝卜细胞质雄性不育恢复系。

具体地：分别提取可育株单株幼嫩叶片的基因组DNA，并以基因组 DNA为模板，利用引物进行PCR扩增；

用于筛选的分子标记为BonJon(参见Primard-BrissetCetal.2005.A newrecombineddoublelowrestorerlinefortheOgu-INRAcmsinrapeseed (BrassicanapusL.).Theor.Appl.Genet.111:736-746.)、OPF10(参见WuYet al.2000.Abinaryvector-basedlargeinsertlibraryforBrassicanapusand identificationofcloneslinkedtoafertilityrestorerlocusforOgura cytoplasmicmalesterile(CMS).Genome43:102-109.)、OPN20和G26 (ChristopherPSetal.2005.ImprovedfertilityrestorationforOgura cytoplasmicmalesterileBrassicaandmethod.WO2005074671A1,World IntellectualPropertyOrganization.)，根据分子标记的序列分别设计引物并 委托上海生物工程有限公司合成。合成后的引物序列见表1。

表1

PCR程序为：94℃预变性5min；然后94℃变性30s，55℃退火30s (退火温度依据梯度PCR结果而定)，72℃复性45s，循环35次；最后72℃ 保温10min。

将PCR产物保存于4℃冰箱备用。PCR产物电泳后用凝胶成像仪(北 京君意东方，JY04S-3D)记录结果。

本实施例中，改良型恢复系R2000的筛选程序为：

①利用检测OPN20的引物对每株可育株的基因组DNA进行PCR扩 增，检测可育株是否缺失该标记，筛选出缺失OPN20的可育株；

②利用检测OPF10的引物对每株缺失OPN20的可育株的基因组DNA 进行PCR扩增，筛选出缺失OPN20-OPF10的可育株；

③利用检测BonJon的引物对每株缺失OPN20-OPF10的可育株的基 因组DNA进行PCR扩增，筛选出缺失OPN20-OPF10-BonJon的可育株；

④利用检测G26的引物对每株缺失OPN20-OPF10-BonJon的可育株 的基因组DNA进行PCR扩增，筛选出缺失OPN20-OPF10-BonJon但具 备G26的可育株即为改良型恢复系R2000。

通过以上程序最终筛选出一株编号为RC947的可育单株，即为本实 施例的改良型恢复系R2000。RC947单株与原始恢复系R2000的分子标记 比对分析结果见表2和图2。

表2

由表2可见，在原始恢复系R2000中四个分子标记均被检测到，而在 RC947单株中均无检测到OPN20、OPF10、BonJon，但G26仍然存在； 这表明RC947单株的恢复基因仍然存在，对Ogura细胞质雄性不育系仍 然具有恢复育性能力，同时也缺失了原始恢复系R2000所具备的不良农艺 性状。

因此，RC947单株含有更短的萝卜恢复基因片段，是获得的新恢复株 系，可作为Ogura细胞质雄性不育三系杂交育种的新恢复材料。

本文标签： 细胞质甘蓝雄性油菜萝卜