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赖氨酸

赖氨酸-葡萄糖模拟体系中吡咯素生成条件的研究

张瑛;袁鑫乐;王静

【摘 要】

研究赖氨酸-葡萄糖(Lys-Glu)模拟体系中吡咯素的生成条件.构建赖氨酸-葡萄糖模拟体系,以吡咯素生成量为评价指标,采用高效液相谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)检测模型中吡咯素含量,在单因素试验的基础上采用Box-Behnken方法,通过响应面设计优化Lys-Glu模拟体系中吡咯素生成的最优条件,对吡咯素生成的加热时间、反应温度、缓冲溶液pH值、原料配比4个因素进行了探究.试验结果表明,加热时间、反应温度和原料中葡萄糖浓度对吡咯素的生成均有显著影响(P<0.05),并且Lys-Glu模拟体系在110℃,葡萄糖浓度0.5 mol/L、赖氨酸浓度0.6 mol/L,缓冲溶液pH值为7.4的条件下反应50 min,可得到吡咯素的最大生成量4.69μmol/L.

面袋【期刊名称】

啉《食品研究与开发》

【年(卷),期】

2019(040)003

【总页数】

8页(P7-13,44)

【关键词】

ktkp-073食品加工;吡咯素;生成规律;响应面分析;高效液相谱法

【作 者】

张瑛;袁鑫乐;王静

【作者单位】

北京工商大学,北京100048;北京工商大学,北京100048;北京工商大学,北京100048

【正文语种】

中 文

食品加工中的热加工技术可以极大地改变食品 的化学成分，尤其是加工过程发生的美拉德反应（maillard reaction）。在美拉德反应中，还原糖的羰基与多肽或者蛋白质以及游离型氨基酸中的氨基最终生成棕混合物[1-2]。美拉德反应分为3个阶段，包括早期、晚期和末期[3]。1984年Brownlee等科学家首次提出晚期糖基化终产物（advanced glycation end products，AGEs）的概念[4]。AGEs是指在非酶条件下发生的美拉德反应，生成一类稳定、不可逆的化合物，能够通过膳食而进入人体[5]。AGEs会加速人体产生视网膜病变，神经病变和肾脏疾病以及与之相关的糖尿病微血管并发症[6-7]。AGEs种类繁多，主要包括羧甲基赖氨酸（Nε-（carboxymethyl）lysine，CML）[8-10]、戊糖素（pentosidine）[1

虚拟墓地1-12]、吡咯素（pyrraline）[13-14]和丙酮醛（methylgalyoxal，MG）[15]。而对吡咯素的研究相较于其他AGEs较少，因此本文将通过葡萄糖-赖氨酸模拟体系来研究吡咯素的生成规律，为食品加工工艺提供理论支持。

吡咯素最先被Nakayama等[16]在模拟体系中发现，是AGEs的主要存在形式之一，含有一个Lys残基，其生成机理是由Lys中的氨基与美拉德反应中期产物的降解物3-脱氧葡萄糖醛酮通过化学反应生成，其性质为无荧光性、非交联产物，属于一种Lys衍生物。吡咯素在结构上属于C6-吡咯化合物[17]，在体内体外的形成路径包括多元醇路径和美拉德反应路径，3-脱氧葡萄糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）是吡咯素生成的重要的中间产物，既可以通过多元醇途径的3-磷酸果酸产生，也可以通过Amadori产物降解生成[3]。有研究发现，糖尿病患者血清中的吡咯素浓度高于健康人[18]。此外，免疫学研究发现动脉粥样硬化患者体内的吡咯素会在肾小球基底膜中积聚，最终导致肾功能衰竭[19]。因此，可以作为人类健康和AGEs定量检测指标的吡咯素受到极大的关注。Wellner A等发现未加工的生胡萝卜中未检测到吡咯素的存在，而加工后的胡萝干中吡咯素的含量高达378 mg/kg Pro[20]。Liang等报道了27种富含肽类的固体饮料中吡咯素含量为150 μg/L～760 μg/L[21]。Yu等发现在早餐谷物，面类食物和烘焙产品中，吡咯素及其结构类似物的含量高达34.8 mg/kg[22]

。研究加工过程各条件对吡咯素形成的影响，对于有效控制并降低在食品加工和贮藏过程中的形成具有重要意义。

该文选用食品中常用的葡萄糖以及生成吡咯素所必需的反应物赖氨酸来构建葡萄糖-赖氨酸（glucose-lysine，Lys-Glu）模拟体系，采用高效液相谱法（high performance liquid chromatography，HPLC） 检测吡咯素的含量，研究加热温度与时间、原料配比和体系pH值对吡咯素形成的影响，为食品加工过程中吡咯素的形成和抑制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

赖氨酸、葡萄糖（纯度＞99%）：郑州博研生物科技有限公司；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠（分析纯）：西陇科学股份有限公司；氨水（5%）、甲醇（分析纯）（纯度≥99.5%）：北京化工厂；三氟乙酸（TFA）、乙腈、甲醇（谱纯）：北京百灵威科技有限公司；超纯水（≥18 MΩ·cm-1）：美国 Labconco-WaterPro 超纯水仪。

1.2 仪器与设备

JA5003电子天平：上海精密科学仪器有限公司；HH-2恒温水浴锅：金坛市杰瑞尔电器有限公司；DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器：巩义市予华仪器有限责任公司；OasisTMHLB 固相萃取柱（3 cc，60 mg）：沃特世科技（上海）有限公司；Starter2000 pH计：美国奥豪斯（上海）有限公司；LC－20AT高效液相谱仪、Inertsil ODS-SP（4.6 mm×250 mm，5 μm）谱柱：岛津（中国）有限公司；UGC－24M氮吹仪：北京优晟联合科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 加热时间对Lys-Glu模拟体系中吡咯素形成的影响

准确称取2.923 8 g赖氨酸和3.603 2 g葡萄糖置于烧杯中，用磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer solution，PBS）（0.1 mol/L，pH=7.4）将其溶解，并定容至 200 mL，配制赖氨酸和葡萄糖浓度为0.1 mol/L的标准溶液。分别准确移取3 mL赖氨酸与葡萄糖的标准混合溶液于5 mL可密封的耐高压高温玻璃管中，在80℃的水浴条件下分别加热 10、20、40、60、80 min，随后置于冰水浴中冷却至25℃。测定不同加热时间下Lys-Glu模拟体系中吡咯素的生成情况。每个梯度做3次平行试验。

1.3.2 加热温度对Lys-Glu模拟体系中吡咯素形成的影响

Lys-Glu模拟体系构建方法见1.3.1。为模拟低温和高温热加工环境，试验中采用水浴加热和油浴加热的两种加热模式。将若干装有3 mL赖氨酸-葡萄糖模拟体系的耐高压高温玻璃管分别置于80、90、100、110、120℃条件下加热40 min，然后取出置于冰水浴冷却至室温。测定不同加热温度下Lys-Glu模拟体系中吡咯素的生成情况。平行试验同1.3.1。

1.3.3 pH值对Lys-Glu模拟体系中吡咯素形成的影响

准确配置 pH 值分别为 6.0、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8的PBS缓冲溶液。后续处理同1.3.1。在80℃条件下加热40 min后，放于冰水浴冷却至室温待测。探究在不同pH值的PBS缓冲溶液条件下Lys-Glu模拟体系中吡咯素生成量的变化。平行试验同1.3.1。

1.3.4 原料配比对Lys-Glu模拟体系中吡咯素形成的影响

以 PBS缓冲溶液（0.1 mol/L，pH=7.4）为溶剂溶解赖氨酸和葡萄糖，准确配制不同原料比的赖氨酸-葡萄糖PBS缓冲液。保持葡萄糖的浓度为0.1 mol/L不变，改变赖氨酸的浓度分别为 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mol/L。准确移取不同原料配比的反应液3 mL置于5 mL耐高

温高压的密封玻璃管，拧紧密封，在80℃条件下加热40 min后，放于冰水浴冷却至室温待测。保持赖氨酸的浓度为0.1 mol/L不变，改变葡萄糖的浓度为0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mol/L，准确移取不同原料配比的反应液3 mL置于5 mL耐高温高压的密封玻璃管，拧紧密封，在80℃条件下加热40 min后，放于冰水浴冷却至室温待测。测定在不同原料配比条件下模拟体系中吡咯素生成量的变化。平行试验同1.3.1。

1.3.5 吡咯素含量的测定（HPLC法）

先将HLB萃取柱预活化（活化程序：依次通过3 mL甲醇、3 mL水），然后将经过不同条件处理所得的反应液（3 mL）加入活化的萃取柱中，吸附完成后，取3 mL去离子水洗涤，再加入3 mL甲醇洗涤，最后加入洗脱液（5%氨水）对目标物进行洗脱，并用10 mL离心管收集洗脱液。在35℃的恒温条件下，氮气吹扫干燥所收集的洗脱液，并复溶于流动相（去离子水）中，0.22 μm滤膜过滤后封装于液相小瓶，按照所建立的HPLC法测定吡咯素含量。所有样品均需做3次平行试验。

试验中高效液相谱条件根据Portero-Otin[22]做了相应的调整。具体液相谱条件如下：

谱柱：Inertsil ODS-SP柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相 A：0.1%TFA 水溶液，流动相 B：乙腈-水（1 ∶1，体积比）；梯度洗脱程序：在 10、30、35、40、45 min时流动相B的体积分别为0%、15%、20%、100%、0%；分析时间：45 min；流速：1.0 mL/min；进样量：5 μL；柱温：室温；紫外-可见光检测器检测波长：297 nm。

1.4 统计分析方法

采用SPSS Statistics 17.0软件进行各因素及其交互作用与模型的显著性统计分析，Design Expert软件进行响应面法优化模拟体系中吡咯素的生成条件，所有样品进行3次重复测定。

2 结果与分析

2.1 绘制吡咯素标准曲线

参照1.3.5的试验条件，选取ODS谱柱为固定相，流动相A为0.1%TFA水溶液，流动相B为乙腈-水（体积比，1∶1），对吡咯素标准溶液进行液相分析见图1。

图1 吡咯素标样的谱图和标准曲线图Fig.1 Chromatogram（a）and standard curve（b）of pyrraline

数字天线如图1a和图1b所示，吡咯素保留时间为21.690 min。在吡咯素浓度为 5×10-7mol/L～2×10-3mol/L的范围之内，摩尔浓度与峰面积间线性趋势良好，回归方程为：Y=4.55×109X-4 140.41，R2=0.999 9。

无纺布面膜2.2 加热时间对Lys-Glu模拟体系中吡咯素形成的影响

通过单因素试验探究加热时间对吡咯素生成的影响见图2。

图2 加热时间对模拟体系中吡咯素生成的影响Fig.2 Effect of heating time on the formation of pyrraline in model system不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

如图2所示，当反应时间为40 min时模拟体系中吡咯素的生成量达到最大为1.24 μmol/L。从整个结果图展现的趋势来看，吡咯素生成量随着加热时间的延长，呈现出先升高后降低的趋势，即模拟体系中吡咯素生成拥有最适加热时间。加热时间短，吡咯素生成量低，可能是吡咯素生成模拟体系赖氨酸-葡萄糖反应不彻底所导致。加热时间长，吡咯素生成量依然不高，原因可能是加热时间太长导致已经生成的吡咯素变成其他物质。经过显著性试验分析后发现，加热时间为40、60 min时吡咯素生成量无显著性差异，根据节约试验成本的

原则，试验选定40 min作为加热时间。在后续优化生成条件试验中也选取40 min作为加热时间。

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