用于制造癌症组合物的方法

admin管理员组

文章数量:866648

本文提供的是制造式I的化合物的方法以及在这样的工艺中涉及的某些中间体。

1.一种用于制造式1的化合物的方法：所述方法包括：(a)使式2的化合物发生反应以产生式3的化合物和(b)使所述式3的化合物发生反应以获得式5的化合物和(c)将所述式5的化合物溶解并与三氟乙酸(TFA)混合以获得式6的化合物和(d)使所述式6的化合物与式7的化合物在二甲基甲酰胺(DMF)、羟基苯并三唑水合物(HOBt)和12-ADT-TFA的混合物中发生反应，和(e)添加二异丙基乙胺(DIPEA)和(3-二甲基氨基丙基)乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC-HCl)以产生式8的化合物和(e)使所述式8的化合物发生反应以产生式9的化合物和(f)纯化所述式9的化合物以产生所述式1的化合物。 2.如权利要求1所述的方法，其中使用在乙醇中的乙醇钠进行步骤(a)。 3.如权利要求1或2所述的方法，其中使用4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)、所述式4的化合物、二氯甲烷和二异丙基碳二亚胺(DIC)进行步骤(b)。 4.如权利要求1、2或3所述的方法，其中使用二氯甲烷(CHCl)进行步骤(c)中的所述溶解。 5.如权利要求1、2、3或4所述的方法，其中使用二氯甲烷、三乙基硅烷(EtSiH)和三氟乙酸进行步骤(e)。 6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中使用C18反相色谱法进行步骤(f)。 7.如权利要求6所述的方法，其中步骤(f)还包括使用浓缩柱。 8.一种制造式4的化合物的方法，包括以下方案 9.一种使用权利要求8所述的方法制造具有式Boc-(CH)-NH的化合物的方法，其中n是大于2的整数，其中用于这样的方法的起始物料是具有式(CH)-NH的化合物，其中n是大于2的整数。 10.一种化合物，具有式1、式2、式3、式4、式5、式6、式7、式8、式9、式10、式11或式12的式中的任一种。 11.一种化合物，具有权利要求8或9中示出的化合物中的任一种的式。 12.一种化合物，具有式Boc-(CH)-NH，其中n是大于2的整数。 13.一种化合物，通过权利要求1或9所述的方法产生。 14.一种用于制造式6的化合物的方法：所述方法包括：(a)使式2的化合物发生反应以产生式3的化合物和(b)使所述式3的化合物发生反应以获得式5的化合物和(c)将所述式5的化合物溶解并与三氟乙酸(TFA)混合以获得所述式6的化合物。 15.如权利要求14所述的方法，其中使用在乙醇中的乙醇钠进行步骤(a)。 16.如权利要求14或15所述的方法，其中使用4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)、式4的化合物、二氯甲烷和二异丙基碳二亚胺(DIC)进行步骤(b)。 17.如权利要求14、15或16所述的方法，其中使用二氯甲烷(CHCl)进行步骤(c)中的所述溶解。 18.一种化合物，通过权利要求14所述的方法产生。

优先权

本申请要求2013年3月15日提交的美国临时申请第61/791,909号的优先权，该临 时申请在此通过引用以其整体并入。

发明领域

本发明涉及制造对癌症有用的前药化合物的方法。在一个实例中，本发明涉及制 造前药的方法以及制造其某些中间体的方法，所述前药包括连接至具有序列Asp-Glu*Glu* Glu*Glu(其中用*指示的键中的至少一个是γ羧基键合)的肽的天冬氨酸的毒胡萝卜素衍生 物8-O-(12-氨基十二烷酰基)-8-O-去丁酰基毒胡萝卜素(12ADT)，并且具有式1的式：

本发明还涉及通过本文阐明的工艺获得的化合物和中间体。

发明背景

一种肽前药化合物，其被鉴定为G-202并且包括被连接至具有序列Asp-Glu*Glu* Glu*Glu(其中用*指示的键中的至少一个是γ羧基键合)的肽的天冬氨酸的毒胡萝卜素衍生 物8-O-(12-氨基十二烷酰基)-8-O-去丁酰基毒胡萝卜素(12ADT)，并且具有以下结构式：

(式1)已经在美国专利第7,767,648号和第7,468,354号中阐明并描述，该美国专 利以其整体并入本文。包含G-202的可注射的癌症组合物和用于使用G-202治疗肝细胞癌的 方法和组合物也在美国临时申请第61/714,662号和第61/693,273号中公开，该临时申请以 其整体并入本文。

对于产生G-202的工艺的主要挑战是由于缺乏任何中间体或最终的活性药物成分 (API)的结晶性。这阻止了在合成中的任何位置使用结晶来除去杂质。此限制使反应应当是 高效的且产生很少至没有杂质成为必要。此外，结晶性的缺乏增加了诸如以下的交替的纯 化工艺的价值：水溶液萃取、极性/非极性有机分配、沉淀、研碎和有效的色谱纯化。本文公 开的此工艺成功地并入了有效的合成策略和所有的这些纯化技术以生成纯的G-202。

发明概述

在一个方面中，本发明提供用于制造具有化学名称8-O-(12-氨基十二烷酰基)-8- O-去丁酰基-毒胡萝卜素)天冬氨酸-γ-谷氨酸-γ-谷氨酸-γ-谷氨酸-谷氨酸OH的式I的化 合物的方法：

所述方法包括：

(a)对毒胡萝卜素(Tg)(式2)进行改性

以得到化合物8-O-去丁酰基-毒胡萝卜素(DBTg)(式3)：

和(b)在二甲基氨基吡啶(DMAP)、二异丙基碳二亚胺(DIC)和CH2Cl2的存在下添加 化合物Boc-12-AD(式4)：

以得到Boc-12ADT(式5)：

和(c)使Boc-12ADT脱保护以得到12ADT(式6)：

和(d)在乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、二异丙基乙胺(iPr2NEt)、羟基 苯并三唑(HOBt)和二甲基甲酰胺(DMF)的存在下将12-ADT与Boc-Asp-Glu(OtBu)-Glu (OtBu)-Glu(OtBu)-OtBu(式7)：

组合以得到PG-202(式8)：

和(e)使PG-202发生反应以得到化合物，粗制的G-202(式9)：

和(f)然后将粗制的G-202转化为式1的化合物。

在本发明的另一个实施方案中，提供了制造化合物BOC-12-AD(式4)的方法：

所述方法包括：

(i)在乙酰氯(AcCl)的存在下使化合物12-AD(式10)：

与甲醇(MeOH)发生反应以得到式11的化合物：

和(ii)在4-二甲基氨基吡啶(DMAP)和叔胺碱R3N的存在下使式11的化合物与二- (叔丁基)二碳酸酯(Boc2O)发生反应以得到式12的化合物：

其中所述叔胺可以是但不限于三乙胺(Et3N)、二异丙基乙胺(iPr2NEt)或N-甲基吡 啶，和(iii)使式12的化合物发生反应以产生式4的化合物(Boc-12-AD)。

本发明还涉及新颖的式1至式12的化合物(包括其变型和衍生物)、通过本文公开 的方法产生的式1至式12的化合物(包括其变型和衍生物)、以及可以使用本文提供的方法 产生或生成的其他化合物。

本发明涉及这些以及下文描述的其他重要的目标。

附图简述

图1示出产生G-202的总反应的示意图。

具体实施方式

按照长期存在的专利法公约，术语“一个(a)”、“一个(an)”和“所述(the)”当在本 申请(包括权利要求书)中使用时是指“一个或更多个”。因此，例如，提及“一个受试者”包括 多个受试者，除非上下文清楚地是相反的(例如，多个受试者)，等等。

为了此说明书和所附权利要求书的目的，除非另外说明，否则表达量、大小、尺寸、 比例、形状、制剂、参数、百分比、参数、数量、特性的所有的数和在说明书和权利要求书中使 用的其他数值，应当被理解为在所有情况下都被术语“约”修饰，即便术语“约”可能没有清 楚地与这些值、量或范围一起出现。

除非另外定义，否则本文中使用的所有的技术和科学术语都具有与本发明所属领 域的普通技术人员所一般理解的一样的含义。虽然与本文描述的那些相似的或等同的任何 机械、材料和方法可以被用于实践或测试本发明，但现在描述优选的机械、材料和方法。本 文提及的所有出版物被引用的目的是用于描述和公开在出版物中报道的并且可能关于本 发明的各种实施方案被使用的细胞系、方案、试剂和媒介物。本文决不应当被解释为承认本 发明没有根据现有的发明先于这样的公开内容的权利。

如本文使用的术语“G-202”是指具有式1的化学结构的8-O-(12-氨基十二烷酰 基)-8-O-去丁酰基-毒胡萝卜素)天冬氨酸-γ-谷氨酸-γ-谷氨酸-γ-谷氨酸-谷氨酸OH。

G-202是毒胡萝卜素前药，其含有偶联于抑制其生物活性直至在肿瘤位点处的蛋白 水解性裂解的掩蔽肽(maskingpeptide)的毒胡萝卜素的细胞毒性类似物。毒胡萝卜素自身 是天然产物，其被化学改性为8-O-(12-氨基十二烷酰基)-8-O-去丁酰基-毒胡萝卜素) (12ADT)。此毒胡萝卜素类似物在掩蔽肽Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-GluGlu的N末端处被偶联于 Asp的β羧基，以产生前药(12ADT)-Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-GluGluOH(G-202)。

G-202的化学名称是(8-O-(12-氨基十二烷酰基)-8-O-去丁酰基-毒胡萝卜素)天冬 氨酸-γ-谷氨酸-γ-谷氨酸-γ-谷氨酸-谷氨酸OH。其有时以如下缩写形式被提及： (12ADT)Asp-γ-Glu-γ-Glu-γ-Glu-GluOH，其中12ADT代表毒胡萝卜素衍生物并且Asp-γ- Glu-γ-Glu-γ-Glu-GluOH代表PSMA可裂解的掩蔽肽。G-202是具有1409.52的分子量的棕 褐色至白色的固体。

G-202由偶联于天然产物毒胡萝卜素的高细胞毒性类似物的PSMA选择性的5氨基酸 肽底物组成。参见，例如，Denmeade,S.R.,等人，J.Natl.CancerInst.2003；9:990-1000；和 美国专利第7,767,648号和第7,468,354号。毒胡萝卜素从作为遍及地中海盆地的野草生长 的植物毒胡萝卜(Thapsiagarganica)的种子中分离。参见，例如，Rasmussen,U.,等人，Acta Pharm.Suec.1978；15:133-140。毒胡萝卜素通过强力抑制关键的细胞内蛋白、肌质/内质网 状钙ATP酶(sarcoplasmic/endoplasmicreticulumcalciumATPase，(SERCA))泵起作用， 该SERCA泵的正常功能是维持所有细胞类型中的细胞内的钙体内平衡。SERCA泵的适当功能 被需要用于所有细胞类型的生命力。因此，毒胡萝卜素对SERCA泵的抑制导致所有测试的细 胞类型(正常的和恶性的两者)的死亡。参见，例如，Thastrup,O.,等人， Proc.Natl.Acad.Sci.USA1990；87:2466-2470；Denmeade,S.R.,CancerBiol.Ther.2005； 4:14-22。

基于此，G-202被设计为靶向具有独特的作用机制的此强力的细胞毒素，用于通过 由在前列腺癌的位点内的前列腺癌上皮细胞以及由在其他癌细胞类型(例如肝细胞癌)中 的肿瘤内皮细胞产生的PSMA而选择性地活化。不受任何特定的理论束缚，相信的是，PSMA是 细胞外羧肽酶，其顺次地从G-202前药裂解酸性的氨基酸以最终放出毒胡萝卜素的细胞毒性 的类似物。参见，例如，Pinto,J.T.,等人，Clin.CancerRes.1996；2:1445-1451；Carter, R.F.,等人，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA1996；93:749-753；Mhaka,A.,等人，CancerBiol Ther.2004；3:551-558。被称为12ADT-Asp的此高度亲脂性的类似物在从其水溶性的肽载体 释放后快速地分配到周围的细胞膜中。参见，例如，Jakobsen,CM.,等人，J.Med.Chem.2001； 44:4696-4703。该类似物然后结合至SERCA泵，产生细胞内钙的持续升高，这导致细胞凋亡 的活化(参见，例如，图1A-1D；Denmeade,S.R.,等人.J.Natl.CancerInst.2003；9:990- 1000；Singh,P.,等人，J.Med.Chem.48,3005-3014(2005))。因为12ADT-Asp类似物被细胞外 地释放至肿瘤微环境中，每个细胞不需要产生PSMA以通过前药活化被杀死。通过将活性药 物释放到肿瘤微环境中实现实质上的旁观者效应(bystandereffect)。

对G-202的临床前研究已经证实，前药通过PSMA在体外被选择性地活化并且相对 于PSMA非表达肿瘤细胞对PSMA表达肿瘤细胞是～60倍更大的毒性。PSMA以对宿主动物最低 限度毒性的剂量在体内示出针对一组的前列腺癌、乳腺癌、肾癌、肝癌和膀胱癌的显著的生 长抑制。参见，例如，Denmeade,S.,等人,www.ScienceTranslationalMedicine,第4 卷，第140期:1-12(2012)。

在一个实施方案中，本发明提供用于产生G-202(式1)、粗制的G-202(式9)和某些 中间体的方法。如在图1A-1D中所示出地概述和阐明用于粗制的G-202的总反应方案。

因此，在一个实施方案中，化合物(式2)

被用作起始物料。此化合物与在乙醇中的乙醇钠在-15±5℃的温度下发生反应以 产生

(式3)。接着，此化合物(8-O-去丁酰基-毒胡萝卜素(DBTg))与4-二甲基氨基吡啶 (4-DMAP)、12-(叔-丁氧羰基氨基)十二烷酸(12-Boc-AD)和二氯甲烷发生反应直至获得均 一的溶液。二异丙基碳二亚胺(DIC)被添加到此溶液以获得：

(式5)(Boc-12ADT或12-Boc-ADT)。Boc-12ADT被溶解于二氯甲烷(CH2Cl2)并与三氟 乙酸(TFA)混合以得到：

(式6)(12-ADT)。此后，此化合物12-ADT接着与纯化的肽：

(式7)在二甲基甲酰胺(DMF)和羟基苯并三唑(HOBt)的混合物中发生反应。二异丙 基乙胺(DIPEA)被添加到该混合物，随后是(3-二甲基氨基丙基)乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC- HCl)以产生：

(式8)(PG-202)。接着，此化合物与二氯甲烷、三乙基硅烷(Et3SiH)和三氟乙酸发 生反应以产生化合物：

(式9)(粗制的G-202)。粗制的G-202然后被纯化以产生式1的化合物。

本发明还提供用于产生被用于产生粗制的G-202(式9)的反应物Boc-12-AD(式4) 的方法，如在上文的反应方案中所示。Boc-12-AD的总反应方案可以如下概述和阐明：

以前，Boc-12-AD通过在氢氧化钠的存在下用过量二叔丁基二碳酸酯处理从12-氨 基十二烷酸在一个步骤中被构建(方案1)。在从庚烷重结晶后，所期望的产物被报道以优良 的收率和纯度被获得。然而，由于在HPLC分析时的很小的UV吸收，Boc-12-AD纯度通过NMR确 定。

方案1

当12-氨基十二烷酸在叔丁醇中在40℃下用1.9当量Boc2O和0.98当量的NaOH(5M) 处理、随后后处理并从庚烷中重结晶时，期望的是产生纯的Boc-12-AD。然而，虽然由此方法 产生的材料是雪白的并且是晶状的，但通过lc/ms的分析表明其包含显著的量的三种化合 物，如下所示(方案2)。由于显著的信号重叠，可能的是，这些杂质通过NMR是不可鉴定的。

方案2

因此，通过方案1产生的组分之一是所需要的Boc-12-AD，但其余两个是起始物料 的二聚体。从仅基于lc/ms的结构确认，相信杂质1是游离酸并且相信杂质2是叔丁基酸酐。 对在从庚烷中的第一重结晶之前和之后的材料的分析表明，其在除去这些杂质上不是有效 的。从庚烷中的第二重结晶被发现减少杂质2的量，但没有减少杂质1。材料还可以从乙酸乙 酯或甲基叔丁基醚(MTBE)与庚烷的混合物中重结晶，具有良好的回收率。然而，两种体系减 少杂质2但对杂质1的量具有很小的作用。如果留在反应物中，杂质1将与DBTg发生反应并且 产生贯穿余下的合成的非常难以除去的杂质。

因此，本文提供的是新颖的方法，该方法基本上消除在现有的合成中生成的杂质。 该方法包括经由以下方案3中示出的三步路线生成Boc-12-AD。

方案3

12-氨基十二烷酸的酸催化的酯化生成甲基酯盐酸盐。在此反应之后是将氮保护 为氨基甲酸叔丁酯并且最后水解以给出期望的产物。

虽然此路线较长(3步对1步)，但其是非常高收率的(对每步分别为96％、97％和 98％)并且其基本上消除二聚体杂质的形成。此外，对于将DBTg转化为Boc-12-ADT的反应， 副产物二异丙基脲(DIU)通过从MTBE/庚烷中沉淀而除去；未反应的DIC通过新颖的ACN/庚 烷分配而除去，并且开发了硅胶纯化12-ADT-TFA。

方案3还可用于生成Boc-12-AD的变型，例如具有式Boc-(CH2)n-NH2的化合物，其中 n是大于2的整数。对于这样的化合物，起始物料将具有式(CH2)n-NH2，其中n是大于2的整数 (式13)。

在另一个实施方案中，本发明提供式1至式12的化合物(包括其变型和衍生物)、以 及使用它们的方法。在另一个实施方案中，本发明提供通过本文公开的方法制造的式1至式 12的化合物，包括其变型和衍生物。

实施例

现将通过参考以下的非限制性实施例更详细地描述本发明。

实施例1：8-O-去丁酰基毒胡萝卜素(DBTg)的制备

用709g毒胡萝卜素(对于水和溶剂校正的重量是693g)装载22L的圆底烧瓶(RBF)， 随后是4.6L的乙醇。起动机械搅拌器；搅拌材料直至均一，并且然后用75/25甲醇/水/干冰 浴冷却至-15±5℃。缓慢添加乙醇钠在乙醇(445ml)中的20％溶液，同时保持温度-15±5 ℃。在20分钟时的过程中的反应检查指示完全反应(1％Tg)并且快速添加冰醋酸(85ml)以 猝灭反应。在猝灭后，允许反应加温并在旋转蒸发仪上浓缩以除去大部分的乙醇。将所得的 稠的油溶解于甲基叔丁基醚(MTBE)并用去离子水、饱和碳酸氢钠、去离子水和饱和氯化钠 洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并在旋转蒸发仪上浓缩。在与MTBE(2x)共蒸馏后，所得无 定形的干燥的泡沫/固体被置于真空烘箱中并且在没有加热下干燥15小时又56分钟。DBTg 的重量是613克(95％回收率)，具有通过HPLC面积的97％纯度，并且没有检测到乙醇。该材 料通过所有的技术标准并且被释放。

实施例2：12-ADT-TFA的制备

用607克8-O-去丁酰基毒胡萝卜素(DBTg)、139克4-二甲基氨基吡啶(4-DMAP)、342 克12-(叔丁氧羰基氨基)十二烷酸(12-Boc-AD)和2050ml二氯甲烷装载12升圆底烧瓶。烧瓶 中的内容物被搅拌直至获得均一溶液，随后添加二异丙基碳二亚胺(DIC，192ml)。在3小时 时经过反应检查后，通过在旋转蒸发仪上浓缩除去二氯甲烷，随后用MTBE刮(chase)。试剂 副产物二异丙基脲(DIU)通过从MTBE和庚烷中沉淀随后过滤而除去。将有机母液转移至分 液漏斗并且该材料用0.5MHCl(2x)、0.6M碳酸氢钠(2x)和饱和氯化钠洗涤。有机层经硫酸 钠干燥，过滤并浓缩。为了除去残余的试剂DIC，材料被溶解于乙腈(ACN)并用正庚烷洗涤。 ACN层被转移至旋转蒸发仪，浓缩，并然后与MTBE共蒸馏以除去ACN。所得12-Boc-ADT被溶解 于二氯甲烷，被转移至22L圆底烧瓶并且被冷却至＜10℃。经由加料漏斗添加三氟乙酸，同 时维持温度＜15℃。在30分钟时的过程中反应检查指示没有剩下起始物料。反应溶液被转 移至旋转蒸发仪，浓缩并与二氯甲烷(2x)共蒸馏。材料通过经由硅胶的塞过滤(plug filtration)而进一步纯化。材料用二氯甲烷加载到二氧化硅床上并用二氯甲烷(4柱容积 CV)、10％丙酮/90％二氯甲烷(8CV)以及然后丙酮(20CV)洗脱，以给出658克12-ADT-TFA(对 于两个步骤71％收率)，具有通过面积的98％的纯度，0.12％二氯甲烷和1.6％丙酮。

实施例3：PG-202的制备

通过将肽溶解于MTBE并用0.5MHCl、去离子水和饱和氯化钠洗涤而从肽(774g)中 除去残余的乙酸铵。所得有机溶液经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。这随后溶解于MTBE中并与庚 烷共沸蒸馏。纯化的肽被装载至12LRBF，随后是DMF(1.3L)、羟基苯并三唑水合物(242g)、 12-ADT-TFA(644g)、和另外的1.8LDMF。接着添加DIPEA(153ml)，随后是EDC-HCl。在6小时 又5分钟时的第一反应检查指示剩下很多起始物料(22.6％12-ADT-TFA)。在12小时又24分 钟时的第二反应检查指示反应已经停止(22％12-ADT-TFA)。因此，在13小时又6分钟后添加 另外的EDC-HCl(48g，0.35当量)。允许反应搅拌过夜并且在24小时40分钟时的过程中检查 指示反应已经进行，但仍剩下18％12-ADT-TFA。在25小时又16分钟时，添加另外的DIPEA (153ml，1.22当量)。下一次反应检查(26小时17分钟)示出剩下10％12-ADT-TFA。这表明，另 外的碱驱动反应向前进行。在28小时15分钟时的另一次DIPEA装载(158ml,1.26当量)将反 应推动至95％完成(30小时20分钟)。将反应混合物稀释在MTBE中，用0.5MHCl(2x)、去离子 水(2x)、饱和碳酸氢钠和饱和氯化钠洗涤。有机层经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。PG-202被溶 解于二氯甲烷，置于10kg硅胶上，并用六个柱容积的55％正庚烷：45％丙酮洗脱。洗脱液在 旋转蒸发仪上浓缩，并与MTBE共沸，以给出1048.7克作为灰白色粉末的PG-202(72％收率)， 其通过所有技术标准。纯度是89％并且材料包含2.9％MTBE、0.76％正庚烷和0.049％DMF。

实施例4：粗制的G-202的制备

用PG-202(500克)、2.8升二氯甲烷和360ml三乙基硅烷装载22L圆底烧瓶。材料被 搅拌直至均一，并且然后被冷却至≤10℃。添加三氟乙酸(2.8L)同时维持温度≤10℃(31分 钟)。反应在≤10℃下搅拌34分钟并然后移除冷却浴，并且允许反应加温至室温。在16小时 又52分钟后的反应检查指示反应完成。反应混合物被转移至旋转蒸发仪并浓缩为油状物。 这之后是与DCM(4x5.5L)的共蒸馏以得到固体，该固体在≤40℃的真空烘箱中干燥持续12 小时又6分钟以给出513克作为灰白色粉末的粗制的G-202(68.5％收率)。通过HPLC面积％ 的纯度是79％和50.5重量％。材料通过所有的技术标准并被释放。

粗制的G-202通过C18反相色谱法随后的浓缩柱而纯化，所述浓缩柱在冻干之前减 少水的体积并将TFA盐转化为游离碱。G-202在若干试验(run)中纯化，其中一个实施例在下 文中描述。

实施例5：反相色谱纯化Biotage150LKP-C18-HS柱-试验1

用于第一试验的载荷是粗制的G-202(HCN5541-08411-A)，其被溶解于2.64L 50％ACN/WFI与0.1％TFA，用WFI稀释至35％，并储存在环境温度下过夜。载荷溶液通过烧结 玻璃过滤器(4-5.5μm)过滤并被加载到柱上。柱用35％、然后40％、随后45％乙腈/WFI与 0.1％TFA洗脱。洗脱通过在235nm下的UV监测。如所期望的，G-202在45％乙腈/WFI与0.1％ TFA中洗脱掉。当G-202离开柱时，一加仑级分被收集并通过短HPLC方法(P/N5300.000)测 定。基于HPLC色谱纯度，将具有面积％>95％的级分合并以制成两个小池(mini-pool)(45％ F3-F18和45％F4-F17)，它们通过HPLC(P/N5289)分析。两个小池都示出>98％色谱纯度。因 此，45％F3-F18被合并以给出含有95.7gG-202的G-202产物池(54L)，如通过使用G-202TFA 盐(2695-64-15)作为标准物的HPLC所确定的。

实施例6：浓缩-纯化柱试验1

用给定体积的水稀释来自试验1的G-202产品池(54L)以制成25％can/WFI溶液，并 再加载在Biotage150MKP-C4-WP柱上，该柱已经用25％ACN/WFI(20L)平衡。柱用25％ACN/ WFI淋洗以除去TFA，并且用40％ACN/WFI淋洗以除去具有RRT0.65的杂质。在40％ACN/WFI 洗脱的最后，G-202开始离开。用90％ACN/WFI继续洗脱C4-WP柱。G-202在约4L的40％ACN/ WFI和15L的90％ACN/WFI中浓缩。

实施例7：氨基甲酸叔丁酯保护的连接基(BOC-12-AD)(式4)的合成

根据以下的方案合成BOC-12-AD：

22L3NRBF用N2冲洗并置于N2放出阀(bleed)下。烧瓶用14LMeOH随后的825mL (2.5当量)乙酰氯装载，乙酰氯经由加料漏斗经约45分钟添加。在添加期间存在约10℃的升 温。所得溶液被冷却至<25℃并且1.0Kg(1.0当量)的(1，如上文的方案中所示)在室温下一 次性全部添加。反应混合物在室温下搅拌约1.5小时并基于LC/MS被视为完全。反应混合物 浓缩至约4.5L的总体积，除去了大部分MeOH以形成稠的白色浆料。在室温下向该浆料中添 加5.5L的MTBE并将所得悬浮液冷却至<10℃持续约1小时。产物经由过滤分离并用约3L冷 MTBE洗涤3次。产物(2，如上文的方案中所示)在过滤器上短时间干燥，转移至干燥盘并在约 45℃的真空烘箱中进一步干燥过夜以给出1197g作为白色晶状固体的(97％)回收率的(2)。

22L3NRBF用N2冲洗并置于N2放出阀下。烧瓶用525g(1.0当量)的(2)、6.0L的 CH2Cl2、24.1g(0.1当量)的DMAP和451g(1.05当量)的Boc2O装载。以上材料用2.0L的另外的 CH2Cl2向前淋洗。接着，经20-25分钟经由加料漏斗逐滴添加577mL(2.1当量)的三乙胺。在添 加期间存在轻微升温和适度的气体释放。在添加期间形成淡琥珀色溶液。反应混合物在室 温下搅拌约1小时并TLC确定完成。反应混合物用3.0L的CH2Cl2稀释并添加3.0L的1MHCl、之 后搅拌约10分钟。分层并且有机物用1x3.0L的饱和NaHCO3洗涤。有机物经Na2SO4干燥，过滤 并浓缩至约1.0至1.4L总体积，形成很明亮的悬浮液。干燥的盐用总计1.0L的MTBE洗涤3次。 MTBE经由在旋转蒸发仪上的浓缩除去，回到约1.0L的总体积，以除去残余的CH2Cl2。形成的 明亮的悬浮液用1.5L另外的MTBE稀释并搅拌过夜。不溶性的脲杂质经由过滤除去并且固体 用少量MTBE洗涤三次。含有产物的滤液与来自第二试验(相同规模)的滤液合并并且合并的 滤液被浓缩至约1-1.4L的体积，产生稠的淡绿色澄清的油状物。该油状物在搅拌下被冷却 至室温。在冷却过程期间，产物开始结晶。在室温下向搅拌的悬浮液中添加3.0L庚烷并将悬 浮液进一步冷却至<10℃。悬浮液在<10℃下保持约1.5小时，之后经由过滤分离。产物(3)用 总计2.0L冷庚烷洗涤3x，在漏斗上短时间干燥并且转移至干燥盘。产物在室温下在全真空 (fullvacuum)下干燥过夜以给出1247g作为白色晶状固体的(96％)回收率的(3)。

22L3NRBF用N2冲洗并置于N2放出阀下。烧瓶用5.3LMeOH装载并开始搅拌。接着， 550g(1.0当量)的(3)被添加并用另外的2.0L的MeOH淋洗。向搅拌的溶液中经由加料漏斗经 约30-40分钟添加4.17L的1MNaOH(2.5当量)。所得浆料被加热至约50℃并在30分钟后通过 TLC完成。在加热期间形成溶液。将溶液冷却至<30℃并用1.0L的6MHCl猝灭，经30分钟(pH ～3)形成白色浆料。该浆料在室温下搅拌约1小时并且经由过滤分离产物(4)。产物用约1.0 至1.5L的DI水淋洗出烧瓶，产物用1.0L水分两部分洗涤，在过滤器上短时间干燥并且转移 至称重的干燥盘。产物在约40℃下在全真空下经周末进一步干燥以给出508.5g作为白色固 体的(97％)回收率的(4)。第二批(相同规模)与第1批进行相同的，并且产生513.7g(4)，收 率98％。

本文中提及的或引用的文章、专利和专利申请的内容以及所有其他的文献和可电 子获得的信息在此通过引用以其整体并入至相同的程度，如同每个单独的出版物被特别地 和单独地指示为通过引用并入。申请人保留将来自任何这样的文章、专利、专利申请或其他 文献的任何以及所有的材料和信息完全地并入本申请的权利。

本文中例证性地描述的本发明可适宜地在不存在在本文中未明确公开的任何一 个或更多个要素、一个或更多个限制的情况下实践。因此，例如，术语“包括”、“包含”、“含 有”等应当宽泛地并且没有限制地解读。此外，在本文中使用的术语和表达已被用作描述且 不是限制的术语，并且不意图在这样的术语和表达的使用中排除所示出和描述的特征的任 何等同物或其部分，但应认识到，在要求保护的本发明的范围内，多种修改是可能的。因此， 应当理解，虽然本发明已经通过优选实施方案和任选的特征而被具体地公开，但在本文中 公开的其中包含的本发明的修改和变型可以诉诸于本领域技术人员，并且这样的修改和变 型被视为在如由所附权利要求所定义的本发明的范围内。

在本文中已经宽泛地并且一般性地描述了本发明。落在一般性公开内容中的每个 较窄的种类和亚种类分组也形成本发明的一部分。这包括本发明的一般性描述以及从类别 中除去任何主题的前提或负限制，不管删除的材料在本文中是否被特别地叙述。

根据本公开内容，本文中公开的和要求保护的所有组合物和方法都可被制造且执 行而不经过过多的实验。虽然本发明的组合物和方法已经关于优选的实施方案被描述，但 将对本领域技术人员明显的是，变型可应用于组合物和方法以及应用于本文描述的方法的 一系列步骤中的步骤中，而不偏离本发明的构思、精神和范围。更具体地，将明显的是，化学 上以及生理学上两者相关的某些试剂可被本文中描述的试剂替换，同时将获得相同的或相 似的结果。对于本领域技术人员明显的所有这样的类似的替代物和修改被视为在如通过所 附权利要求定义的本发明的精神、范围和构思内。

其他实施方案在以下的权利要求书中阐明。

本文标签： 组合癌症方法