一种大叶藻体细胞胚的诱导方法

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本发明涉及一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，是以大叶藻的佛焰苞花序为外植体，将经表面消毒处理的花序切为3-5mm长的片段，接种到体细胞胚诱导培养基上，在15-25℃、黑暗或弱光照条件进行诱导培养，每半月转接一次，培养15-25d以后可见到花序上组织萌动，产生小突起，逐渐发育为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。体细胞胚诱导培养基是以MS、N6培养基为基础培养基、并添加有机添加物、碳源、植物激素（生长素、或生长素与细胞分裂素）和海盐的固体培养基。本发明的方法可不经历愈伤组织诱导培养阶段，在短时间内从花序组织上直接诱导出大叶藻体细胞胚，为大叶藻无菌组培苗再生和组培快速繁殖体系的建立提供了重要的技术支撑，也为海草组织培养的成功奠定了基础。

1.一种大叶藻体细胞胚的培养方法，其特征在于，是以大叶藻的花序诱导体细胞胚的外植体。 2.如权利要求1所述的诱导方法，步骤如下：1）外植体的选取：以大叶藻花枝为外植体供体，取其健康幼嫩佛焰苞花序，经表面除杂、清洗后在超净工作台内进行消毒处理，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；2）体细胞胚的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于培养基中，在15-25℃、黑暗或弱光条件下进行培养；约15-25d后可见到花序上组织萌动，产生小突起，逐渐发育为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段；胚状体诱导培养基为以MS、N6培养基为基础培养基，并添加水解酪蛋白100-1000mg/L、蔗糖或葡萄糖30-120g/L、植物生长素（或生长素和细胞分裂素）、琼脂5g/L、海盐20-35g/L，培养基pH=6-8。 3.如权利要求2所述的诱导培养方法，其特征在于，优选培养基为以MS培养基为基础培养基，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖60g/L、2,4-D5mg/L、琼脂5g/L、海盐20g/L，pH=7。 4.如权利要求2所述的诱导培养方法，其特征在于，优选培养条件为16℃下暗培养。

技术领域

本发明所属植物组织培养研究领域，本发明涉及一种大叶藻体细胞胚的诱导方法。

背景技术

大叶藻(ZosteramarinaL.)是北半球温带海域分布最为广泛的海草，也是我国北方沿海（山东、河北和辽宁）海草场的优势种，具有极其重要的生态服务功能和经济价值。但近百年来全球大叶藻海草场生态系统遭到了严重的破坏，面积急剧缩小，在我国更甚，因此，近年来大叶藻海草场的修复已成为了我国北方海洋生态系统修复中不可或缺的一项内容，其草场修复中需要大量的种苗，利用植物组织培养技术在室内培养出无菌苗是缓解目前大叶藻修复移栽中种苗短缺的一个有效方法。

尽管植物组织培养技术在许多植物的无菌苗再生和快速繁殖研究领域已成为不再是难题，但在植物组织培养中仍有一条培养难易的基本规律：陆生植物易于水生植物、双子叶植物易于单子叶植物、淡水生植物易于海水生植物，而大叶藻等海草植物则属于海洋生单子叶植物，因此，尽管有相关研究在不同海草中展开，但到目前为止，仍无突破性进展。

体细胞胚又名胚状体，是植物组织培养中无菌苗再生的一个重要的中间环节，它的成功获得可为无菌苗再生奠定重要的基础。

本发明通过大叶藻组织培养技术诱导其体细胞胚，目前采用该技术方案的相关专利和文献未见报导。

发明内容

本发明的目的是提供一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，采用花序为外植体，可有效地获得体细胞胚，为大叶藻的快速繁殖和无菌组培苗再生提供重要的技术支撑。

本发明所采用的技术方案为：

本发明的一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，是以大叶藻的花序为诱导体细胞胚的外植体。

本发明的具体步骤如下：

（1）外植体的选取：以大叶藻花枝为外植体供体，取其健康幼嫩佛焰苞花序，经表面除杂、清洗后在超净工作台内进行消毒处理，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

（2）体细胞胚的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于培养基中，在15-25℃、黑暗或弱光条件下进行培养。约15-25d后可见到花序上组织萌动，产生小突起，逐渐发育为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。体细胞胚诱导培养基为以MS、N6培养基为基础培养基，并添加水解酪蛋白100-1000mg/L、蔗糖或葡萄糖30-120g/L、植物生长素（或生长素和细胞分裂素）、琼脂5-7g/L、海盐20-35g/L，培养基pH=6-8。

本发明中，优选培养基为以MS培养基为基础培养基，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖60g/L、2,4-D5mg/L、琼脂5g/L、海盐20g/L，pH=7。

本发明中，优选培养条件为16℃、暗培养。

本发明的优点在于：大叶藻花期可持续3个月之久，因此外植体供体可获取时间较长；以花序为外植体，表面消毒效果大大提升；体细胞胚诱导过程中不经历愈伤组织诱导和培养阶段，不仅体细胞胚获得时间较短，且有效避免了因愈伤组织不断继代培养过程中导致的细胞基因突变的风险。本发明为大叶藻无菌组培菌再生提供了重要的技术支撑，也为海草组织培养的成功奠定了基础。

具体实施方式

以下通过具体实施方式对本发明进行一步说明，这里特别指出，下面的具体实施方式仅用来说明本发明，本发明还有其它多种植物激素、碳源、有机添加物、盐度等成分组合的实施方式，本领域技术人员在理解本发明精神的前提下，可据本技术领域的现有技术和公知知识对本发明进行相应变换，这些技术方案均落入本发明的保护范围之内。

实施例1：一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其实施步骤包括：

（1）外植体的选取：以大叶藻花枝为外植体供体，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后转入超净工作台内，用10%的过氧化氢溶液浸泡15-20min，灭菌海水冲洗3次后，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

（2）体细胞胚的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于诱导培养基中，在16℃、黑暗条件下和1000lux光照条件下进行培养，每半月转接一次。17d后可见到花序上有小突起产生，约30d后可见这些小突起发育为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。体细胞胚诱导培养基为以MS培养基为基础培养基，pH=7，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖60g/L、2,4-D5mg/L、琼脂5g/L、海盐20g/L。黑暗条件下体细胞胚诱导率为20.52%，光照条件下为18.84%。

实施例2：一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其实施步骤为：

（1）外植体的选取：以大叶藻花枝为外植体供体，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后转入超净工作台内，用10%的过氧化氢溶液浸泡15-20min，灭菌海水冲洗3次后，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

（2）体细胞胚的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于诱导培养基中，在16-20℃、黑暗条件下进行培养，每半月转接一次。20d后可见到花序上有小突起产生，约30d后可见这些小突起发育为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。体细胞胚诱导培养基为以MS培养基为基础培养基，pH=7，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖120g/L、NAA2mg/L、琼脂5g/L、海盐20g/L。体细胞胚诱导率为16.82%。

实施例3：一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其实施步骤为：

（1）外植体的选取：以大叶藻花枝为外植体供体，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后转入超净工作台内，用10%的过氧化氢溶液浸泡15-20min，灭菌海水冲洗3次后，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

（2）体细胞胚的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于培养基中，在16-20℃、黑暗条件下进行培养，每半月转接一次。23d后可见到花序上有小突起产生，约34d后可见这些小突起发育为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。体细胞胚诱导培养基为以MS培养基为基础培养基，pH=7，并添加水解酪蛋白100mg/L、蔗糖30g/L、IAA10mg/L、琼脂5g/L、海盐30g/L。体细胞胚诱导率为9.36%。

实施例4：一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其实施步骤为：

（1）外植体的选取：以大叶藻花枝为外植体供体，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后转入超净工作台内，用15%的过氧化氢溶液浸泡15-20min，灭菌海水冲洗3次后，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

（2）体细胞胚的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于培养基中，在16-20℃、黑暗条件下进行培养，每半月转接一次。15d后可见到花序上有小突起产生，约30d后可见这些小突起发育为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。诱导培养基为以MS培养基为基础培养基，pH=7，并添加水解酪蛋白500mg/L、蔗糖30g/L、噻苯隆0.2mg/L、琼脂5g/L、海盐20g/L。体细胞胚诱导率为20.34%。

实施例5：一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其实施步骤为：

（1）外植体的选取：以大叶藻花枝为外植体供体，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后转入超净工作台内，用15%的过氧化氢溶液浸泡15min，灭菌海水冲洗3次后，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

（2）体细胞胚的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于培养基中，在16-20℃、黑暗条件下进行培养，每半月转接一次。21d后可见到花序上有小突起产生，约40d后可见这些小突起发育为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。诱导培养基为以N6培养基为基础培养基，pH=7，并添加水解酪蛋白1000mg/L、蔗糖30/L、2,4-D5mg/L、6-BA0.5mg/L、琼脂5g/L、海盐20g/L。体细胞胚诱导率为13.15%。

实施例6：一种大叶藻体细胞胚的诱导方法，其实施步骤为：

（1）外植体的选取：以大叶藻花枝为外植体供体，以大叶藻花枝为外植体供体，取其健康幼嫩佛焰苞花序，刮除表面的附生物等，在海水中清洗后转入超净工作台内，用15%的过氧化氢溶液浸泡15min，灭菌海水冲洗3次后，剥去佛焰苞花序外的苞叶，得到无菌的花序；

（2）体细胞胚的诱导培养：将无菌花序切成3-5mm长的外植体片段，接种于培养基中，在22℃、黑暗条件下进行培养，每半月转接一次。19d后可见到花序上有小突起产生，约25d后可见这些小突起发育为体细胞胚，期间不经历愈伤组织阶段。诱导培养基为以N6培养基为基础培养基，pH=7，并添加水解酪蛋白1000mg/L、葡萄糖120/L、2,4-D5mg/L、6-BA0.5mg/L、琼脂5g/L、海盐20g/L。体细胞胚诱导率为10.33%。

本文标签： 体细胞诱导大叶方法