一种海洋芽孢杆菌B9987抑菌活性物质的提取及应用

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本发明涉及生物农药技术领域，具体是一种海洋芽孢杆菌B-9987抑菌活性物质的提取及应用。目的在于提供一种海洋芽孢杆菌B-9987菌株抑菌物质的提取及对确定对于植物真菌病害的最佳防治病原菌；包括(1)海洋芽孢杆菌B9987菌株抑菌物质的提取；(2)抑菌物质的纯化；(3)抑菌物质的应用方法；本发明所用步骤简单，所用到的辅助药剂价格便宜，易于科研人员研究的选用；对植物真菌性病害测定抑菌率，用简易的方法确定防治效果最好的病原菌，为在实践中防治病害的应用提供方便。

1.一种海洋芽孢杆菌B-9987抑菌活性物质的提取方法，其特征在于：将保存的B9987菌株接种于NA培养基上，在25℃条件下培养36小时，取培养后的菌株接种于种子培养基上，在30℃150r/min的条件下培养24小时，转移到发酵培养基中，在30℃150r/min的条件下培养96小时；再将B-9987菌株发酵液在6000r/min离心20min，去除菌体，收集上清液，4℃下静置24h后，于8000r/min离心30min，去除上清液，收集沉淀；获得粗提物；将所得粗提取物，加入甲醇脱盐，用硫酸钠固体干燥剂干燥，加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集萃取液加热蒸发干燥，得到抑菌活性物质。 2.根据权利要求1所述一种海洋芽孢杆菌B-9987抑菌活性物质的提取方法，其特征在于：所述种子培养基为：葡萄糖10g、大豆蛋白胨15g、牛肉浸膏2g、蒸馏水1L。 3.根据权利要求1所述一种海洋芽孢杆菌B-9987抑菌活性物质的提取方法，其特征在于：所述发酵培养基为：蔗糖10g、大豆蛋白胨20g、NaCl9g、KHPo4g、蒸馏水1L。 4.一种海洋芽孢杆菌B-9987抑菌活性物质的应用方法，其特征在于：所选病菌为：腐霉属病菌：茄果类猝倒病和瓜果腐烂病菌；疫霉属病菌为：番茄晚疫病菌和马铃薯晚疫病菌；霜霉属病菌为：黄瓜霜霉病菌和大豆霜霉病菌；白粉属病菌：黄瓜白粉病菌和西瓜白粉病菌；黑粉属病菌：小麦散黑粉病菌；链格孢菌：棉花轮纹斑病和西瓜叶斑病：根霉属为：马铃薯软腐病菌。

技术领域

本发明涉及生物农药技术领域，具体是一种海洋芽孢杆菌B-9987抑菌活性物质的提取及应用。

背景技术

目前开发低毒、高效的生物农药防治病虫害是目前世界的一大重要课题，海洋微生物的药用价值，受到越来越大的重视，发现很多具有抑菌活性的新物质，显示出良好的开发前景；但与医药相比，海洋微生物应用于农药方面的研究相对滞后。

海洋芽孢杆菌B-9987是来源于渤海潮间带盐生植物，对细菌性土传病害病原菌以及真菌性叶部病害病原菌均具有良好的拮抗效果,有望被创制成国内外第一个海洋微生物农药；该菌及代谢产物对植物病原菌真菌具有抑制作用，并且可在抑制病原菌的同时，诱导植物产生抗病作用，可用于增强植物抵抗力，提高防治效果。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海洋芽孢杆菌B-9987菌株抑菌物质的提取及对确定对于植物真菌病害的最佳防治病原菌。

根据上述目的提出具体方案，包括以下步骤：

1、海洋芽孢杆菌B9987菌株抑菌物质的提取

(1)供试菌株

海洋芽孢杆菌B9987菌株，分离自渤海盐生植物盐地碱蓬，菌株保藏号为：CGMCCNo.2095；

(2)抑菌物质的提取

将保存的B9987菌株接种于NA培养基上，在25℃条件下培养36小时，取培养后的菌株接种于种子培养基上，在30℃150r/min的条件下培养24小时，转移到发酵培养基中，在30℃150r/min的条件下培养96小时；再将B-9987菌株发酵液在6000r/min离心20min，去除菌体，收集上清液，4℃下静置24h后，于8000r/min离心30min，去除上清液，收集沉淀；获得粗提物，备用。

所述种子培养基由葡萄糖10g、大豆蛋白胨15g、牛肉浸膏2g、蒸馏水1L组成；

所述发酵培养基由蔗糖10g、大豆蛋白胨20g、NaCl9g、K2HPo44g、蒸馏水1L组成；

2、抑菌物质的的纯化

将所得粗提取物，加入甲醇脱盐，用硫酸钠固体干燥剂干燥，加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集萃取液加热蒸发干燥，得到抑菌活性物质。

3、抑菌物质的应用方法

采用菌丝生长速率法进行测定；选用腐霉属病菌、疫霉属病菌、霜霉属病菌、白粉属病菌、黑粉属病菌、链格孢菌、根霉属；

(1)选取病菌为：腐霉属病菌：茄果类猝倒病和瓜果腐烂病菌；疫霉属病菌为：番茄晚疫病菌和马铃薯晚疫病菌；霜霉属病菌为：黄瓜霜霉病菌和大豆霜霉病菌；白粉属病菌：黄瓜白粉病菌和西瓜白粉病菌；黑粉属病菌：小麦散黑粉病菌；链格孢菌：棉花轮纹斑病和西瓜叶斑病：根霉属为：马铃薯软腐病菌。

(2)测定抑菌率

将所选的病原菌1ml在无菌条件下，接种在PDA培养基中，每个病菌做3的重复，将所提取的活性植物，稀释，喷洒于培养基中，在30℃条件下，培养36小时，观察菌丝生长情况；结果如下所示：

结果显示：海洋芽孢杆菌B9987菌株活性物质提取物对番茄晚疫病菌、马铃薯晚疫病菌、黄瓜霜霉病菌的抑菌率最高，其相应的防治效果最好；对根软腐病抑菌率最低，不易采用海洋芽孢杆菌B9987菌株防治。

本发明的有益效果在于：(1)本发明提供一种操作可靠的病原菌提取方法，所用步骤简单，所用到的辅助药剂价格便宜，易于科研人员研究的选用；

(2)对植物真菌性病害测定抑菌率，用简易的方法确定防治效果最好的病原菌，为在实践中防治病害的应用提供方便。

具体实施方式

例1防治番茄晚疫病

1、海洋芽孢杆菌B9987菌株抑菌物质的提取

(1)供试菌株

海洋芽孢杆菌B9987菌株，分离自渤海盐生植物盐地碱蓬，菌株保藏号为：CGMCCNo.2095；

(2)抑菌物质的提取

将保存的B9987菌株接种于NA培养基上，在25℃条件下培养36小时，取培养后的菌株接种于种子培养基上，在30℃150r/min的条件下培养24小时，转移到发酵培养基中，在30℃150r/min的条件下培养96小时；再将B-9987菌株发酵液在6000r/min离心20min，去除菌体，收集上清液，4℃下静置24h后，于8000r/min离心30min，去除上清液，收集沉淀；获得粗提物，备用。

所述种子培养基由葡萄糖10g、大豆蛋白胨15g、牛肉浸膏2g、蒸馏水1L组成；

所述发酵培养基由蔗糖10g、大豆蛋白胨20g、NaCl9g、K2HPo44g、蒸馏水1L组成；

2、杆菌抑菌物质的的纯化

将所得粗提取物，加入甲醇脱盐，用硫酸钠固体干燥剂干燥，加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集萃取液加热蒸发干燥，得到抑菌活性物质。

3、防治番茄晚疫病

将提取得到的抑菌活性植物，用1％二甲基亚砜溶解，加水稀释10倍，喷施在番茄晚疫病菌发生的植株上。

例2防治黄瓜霜霉病

1、海洋芽孢杆菌B9987菌株抑菌物质的提取

(1)供试菌株

海洋芽孢杆菌B9987菌株，分离自渤海盐生植物盐地碱蓬，菌株保藏号为：CGMCCNo.2095；

(2)抑菌物质的提取

将保存的B9987菌株接种于NA培养基上，在25℃条件下培养36小时，取培养后的菌株接种于种子培养基上，在30℃150r/min的条件下培养24小时，转移到发酵培养基中，在30℃150r/min的条件下培养96小时；再将B-9987菌株发酵液在6000r/min离心20min，去除菌体，收集上清液，4℃下静置24h后，于8000r/min离心30min，去除上清液，收集沉淀；获得粗提物，备用。

所述种子培养基由葡萄糖10g、大豆蛋白胨15g、牛肉浸膏2g、蒸馏水1L组成；

所述发酵培养基由蔗糖10g、大豆蛋白胨20g、NaCl9g、K2HPo44g、蒸馏水1L组成；

2、杆菌抑菌物质的的纯化

将所得粗提取物，加入甲醇脱盐，用硫酸钠固体干燥剂干燥，加水溶解，用乙酸乙酯萃取，收集萃取液加热蒸发干燥，得到抑菌活性物质。

3、防治黄瓜霜霉病

将提取得到的抑菌活性植物，用1％二甲基亚砜溶解，加水稀释10倍，喷施在黄瓜霜霉病发生的植株上。

本文标签： 芽孢杆菌活性抑菌物质