一种金针菇固体转液体的接种方法

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本发明公开了一种金针菇固体转液体的接种方法，经（1）试管培养、（2）平板培养、（3）接种、（4）三角瓶液体培养后，即可用于生产或扩繁。本发明工艺简单，接种简便，有效避免了杂菌感染的可能，同时还能最大限度保证菌种的活力，不会出现菌丝被烫死等情况，接种后的液体三角瓶长势良好，菌球颗粒大小均匀，菌丝旺盛，适合进行大规模的生产。

1.一种金针菇固体转液体的接种方法，其特征在于，包括如下具体步骤：一、试管培养：（1-1）制作斜面试管：500ml斜面试管培养料的原料为：斜面试管专用培养基19.5g、细菌琼脂2.5g、纯净水500ml，ph值自然，将培养料充分搅拌，并在微波炉中加热至溶液呈透明状后，取出分装到20×200mm的试管中，每支试管装13ml培养基，塞上胶塞封上报纸，于121℃条件下灭菌20min；（1-2）接种：将灭菌后的试管趁热摆成斜面，待温度降至室温后开始接种，接种前超净工作台紫外灯消毒20min，于超净工作台中接种，每支试管接种面积为3mm×3mm×3mm的正方体菌种块；（1-3）培养：将接种好的试管放于17℃下的恒温培养箱静置培养7天，即可用于接种平板培养基；二、平板培养：（2-1）制作平板培养基：500ml平板培养基培养料的原料为：斜面试管专用培养基19.5g、细菌琼脂2.5g、纯净水500ml，ph值自然，将培养料充分搅拌，并在微波炉中加热至溶液呈透明状后，取出分装到20×200mm的试管中，每支试管装20ml培养基，塞上胶塞封上报纸，于121℃条件下灭菌20min；（2-2）接种：将灭菌后的试管中的培养基趁热倒入平板中，待平板凝固降至室温后开始接种；接种前超净工作台紫外灯消毒20min，于超净工作台中接种；将接种针深入培养至7天的母种斜面试管，刮掉斜面表面的气生菌丝，将靠近试管口没有菌丝覆盖的培养基质切开弃除，选取靠近接种点附近布满菌丝的培养基画井字形，以长宽高各3mm均匀切块，然后放入平板培养基中央，封上密封条，一支试管转接6个平板培养基；（2-3）培养：将接种好的平板放于17℃下的恒温培养箱静置培养7天左右，即可用于液体三角瓶；三、接种：3-1、液体准备：（3-1-1）配料：每1000ml液体三角瓶培养液所需配料为：白糖20g、豆奶宝3.3g、磷酸二氢钾0.66g、硫酸镁0.66g，称取各种原料进行配料；（3-1-2）装料：将配好的料装入1000ml的三角瓶中，并充分搅拌溶解，放入一个转子，然后用纯水定容至600ml，且要求PH值在6.2至6.5之间；（3-1-3）灭菌：将装好料的三角瓶塞上棉塞，并在棉塞外套上锡箔纸，确保锡箔纸完全包裹住棉塞，然后放于高压灭菌锅中，于121℃条件下灭菌60min后取出；（3-1-4）冷却：将取出的三角瓶在超净台中冷却至18℃至22℃即可准备接种；3-2、接种培养：（3-2-1）消毒：将超净台用紫外灯消毒30分钟，且台上的所有工具用酒精和紫外灯消毒后，由专人穿戴专用接种洁净服，戴口罩及医用手套，穿洁净区工作鞋，风淋后进入洁净区，在超净工作台上准备灭菌操作；（3-2-2）灭菌：将打孔器，接种针所有会深入到平板内的部分通过酒精灯火焰来回灼烧至通红灭菌，然后放置一边冷却；将挑好的平板菌种放入超净台中，并靠近酒精灯火焰附近，撕掉封条，让平板边缘缓缓过火灭菌，切勿烧得过烫；（3-2-3）打孔取块：将接种针深入平板培养基，刮掉斜面表面的气生菌丝，再用直径10mm的打孔器沿着菌丝蔓延生长的边缘均匀打孔一圈；盖上平板盖备用；（3-2-4）接种：将冷却后的液体三角瓶瓶口靠近酒精灯火焰，并取下锡箔纸和棉塞，快速用接种针分别从平板培养基内选取4颗菌种，放置过程中接种针不要触碰三角瓶内壁；操作完成后分别将棉塞和锡箔纸在火焰上过火后，再把三角瓶塞紧包好；四、三角瓶液体培养：（4-1）重复步骤（3-2-2）、（3-2-3）、（3-2-4）操作直至接种结束，每个平板可转接2至3个三角瓶，然后将三角瓶放入摇床中震荡培养，培养温度为20℃，振幅为250r/min；培养至第四天取出三角瓶，将液体菌种打碎20s，然后放回继续培养；培养至第9天取出三角瓶，将液体菌种打碎10min，即可用直接用于生产，也可用于液体转固体或液体转发酵罐的扩繁。

技术领域

本发明涉及一种金针菇固体转液体的接种方法，属于栽培技术类。

背景技术

目前，固体菌种的生产工艺一般是由试管母种扩繁成一级种，二级种、三级种，生产周期长、污染率高、成本高、需大量人工和场地，并且管理困难，很难适应大规模生产的需要。而液体菌种生产设备和技术已经推广多年，拥有液体菌种生产设备的单位和个人不计其数。液体菌种优点很多，例如：食用菌菌种的液体培养可以大大的缩短周期，产量巨大，并且可以大规模生产，液体培养还可以减少杂菌污染，大大的为经营这节约时间。

但是，该液体菌种生产的技术依然存在不足，还需继续研究，比如：实际上成功长期应用于生产的仍很少，这说明液体菌种设备和技术在生产中存在较大的探讨空间，究竟是设备问题还是技术问题、还是液体菌种与栽培技术的结合问题。本发明就金针菇固体转液体的接种方法作探讨，以期得到一个优良的接种方法，避免液体菌种生产中出现的诸多问题。

发明内容

针对上述现存的技术问题，本发明提供一种金针菇固体转液体的接种方法，通过斜面菌种接种到液体培养基中，以提高液体菌种生产的活力。

为实现上述目的，本发明提供的金针菇固体转液体的接种方法，包括如下具体步骤：

一、试管培养：

（1-1）制作斜面试管：500ml斜面试管培养料的原料为：斜面试管专用培养基19.5g、细菌琼脂2.5g、纯净水500ml，ph值自然，将培养料充分搅拌，并在微波炉中加热至溶液呈透明状后，取出分装到20×200mm的试管中，每支试管装13ml培养基，塞上胶塞封上报纸，于121℃条件下灭菌20min；

（1-2）接种：将灭菌后的试管趁热摆成斜面，待温度降至室温后开始接种，接种前超净工作台紫外灯消毒20min，于超净工作台中接种，每支试管接种面积为3mm×3mm×3mm的正方体菌种块；

（1-3）培养：将接种好的试管放于17℃下的恒温培养箱静置培养7天，即可用于接种平板培养基。

二、平板培养：

（2-1）制作平板培养基：500ml平板培养基培养料的原料为：斜面试管专用培养基19.5g、细菌琼脂2.5g、纯净水500ml，ph值自然，将培养料充分搅拌，并在微波炉中加热至溶液呈透明状后，取出分装到20×200mm的试管中，每支试管装20ml培养基，塞上胶塞封上报纸，于121℃条件下灭菌20min；

（2-2）接种：将灭菌后的试管中的培养基趁热倒入平板中，待平板凝固降至室温后开始接种；接种前超净工作台紫外灯消毒20min，于超净工作台中接种；将接种针深入培养至7天的母种斜面试管，刮掉斜面表面的气生菌丝，将靠近试管口没有菌丝覆盖的培养基质切开弃除，选取靠近接种点附近布满菌丝的培养基画井字形，以长宽高各3mm均匀切块，然后放入平板培养基中央，封上密封条，一支试管转接6个平板培养基；

（2-3）培养：将接种好的平板放于17℃下的恒温培养箱静置培养7天左右，即可用于液体三角瓶。

三、接种：

3-1、液体准备：

（3-1-1）配料：每1000ml液体三角瓶培养液所需配料为：白糖20g、豆奶宝3.3g、磷酸二氢钾0.66g、硫酸镁0.66g，称取各种原料进行配料；

（3-1-2）装料：将配好的料装入1000ml的三角瓶中，并充分搅拌溶解，放入一个转子，然后用纯水定容至600ml，且要求PH值在6.2至6.5之间；

（3-1-3）灭菌：将装好料的三角瓶塞上棉塞，并在棉塞外套上锡箔纸，确保锡箔纸完全包裹住棉塞，然后放于高压灭菌锅中，于121℃条件下灭菌60min后取出；

（3-1-4）冷却：将取出的三角瓶在超净台中冷却至18℃至22℃即可准备接种。

3-2、接种培养：

（3-2-1）消毒：将超净台用紫外灯消毒30分钟，且台上的所有工具用酒精和紫外灯消毒后，由专人穿戴专用接种洁净服，戴口罩及医用手套，穿洁净区工作鞋，风淋后进入洁净区，在超净工作台上准备灭菌操作；

（3-2-2）灭菌：将打孔器，接种针所有会深入到平板内的部分通过酒精灯火焰来回灼烧至通红灭菌，然后放置一边冷却；将挑好的平板菌种放入超净台中，并靠近酒精灯火焰附近，撕掉封条，让平板边缘缓缓过火灭菌，切勿烧得过烫；

（3-2-3）打孔取块：将接种针深入平板培养基，刮掉斜面表面的气生菌丝，再用直径10mm的打孔器沿着菌丝蔓延生长的边缘均匀打孔一圈；盖上平板盖备用；

（3-2-4）接种：将冷却后的液体三角瓶瓶口靠近酒精灯火焰，并取下锡箔纸和棉塞，快速用接种针分别从平板培养基内选取4颗菌种，放置过程中接种针不要触碰三角瓶内壁；操作完成后分别将棉塞和锡箔纸在火焰上过火后，再把三角瓶塞紧包好。

四、三角瓶液体培养：

（4-1）重复步骤（3-2-2）、（3-2-3）、（3-2-4）操作直至接种结束，每个平板可转接2至3个三角瓶，然后将三角瓶放入摇床中震荡培养，培养温度为20℃，振幅为250r/min；培养至第四天取出三角瓶，将液体菌种打碎20s，然后放回继续培养；培养至第9天取出三角瓶，将液体菌种打碎10min，即可用直接用于生产，也可用于液体转固体或液体转发酵罐的扩繁。

综上所述，一般固体转液体是用试管直接转接液体培养基，与现有技术相比，本发明的接种方法进行固体转液体的接种，是由固体转平板，再由平板转液体培养基，具有以下优点：

（1）由试管转接平板再转接液体培养基，又多了一个选育的步骤，试管转接平板时会挑选长势良好，菌丝旺盛洁白的试管转接，再转接到平板培养基，培养好又进一步挑选长势良好，菌丝旺盛活力强的平板转接，从而保证将最好的菌种用于生产之中。

（2）试管转接液体培养基，实际使用中一次性会使用多支试管，由于试管之间的菌种长势不一、菌丝状态活力不一，导致接种培养后的液体菌种长势不一致、生长不能一致统一、不便于工厂化管理，而加入平板转接液体培养基，所使用的平板培养基均转自同一根试管，确保菌种长势，活力一致，进一步缩小了同一批液体菌种之间的差异性。

（3）同（2）的原理一样，试管转接液体培养基人工使用接种针勾取均匀小块转接，实际操作中，因环境、人为、操作方法等因素，勾取的接种快大小厚度不一，导致接入后的液体菌种长势不一、菌球颗粒大小不均匀、甚至不萌发，而用平板培养基菌种转接液体培养基，使用的是专门的打孔器，勾取的菌种大小，厚度等完全一致统一，可有效避免杂菌感染的可能，同时还能最大限度保证菌种的活力，不会出现菌丝被烫死等情况，接种后的液体三角瓶长势良好，菌球颗粒大小均匀，菌丝旺盛，适合进行大规模的生产。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

本发明进行固体转液体的接种，可有效避免杂菌感染的可能，同时还能最大限度保证菌种的活力，不会出现菌丝被烫死等情况，具体步骤如下。

一、试管培养：

（1-1）制作斜面试管：500ml斜面试管培养料的原料为：斜面试管专用培养基19.5g、细菌琼脂2.5g、纯净水500ml，ph值自然，将培养料充分搅拌，并在微波炉中加热至溶液呈透明状后，取出分装到20×200mm的试管中，每支试管装13ml培养基，塞上胶塞封上报纸，于121℃条件下灭菌20min；

（1-2）接种：将灭菌后的试管趁热摆成斜面，待温度降至室温后开始接种，接种前超净工作台紫外灯消毒20min，于超净工作台中接种，每支试管接种面积为3mm×3mm×3mm的正方体菌种块；

（1-3）培养：将接种好的试管放于17℃下的恒温培养箱静置培养7天，即可用于接种平板培养基。

二、平板培养：

（2-1）制作平板培养基：500ml平板培养基培养料的原料为：斜面试管专用培养基19.5g、细菌琼脂2.5g、纯净水500ml，ph值自然，将培养料充分搅拌，并在微波炉中加热至溶液呈透明状后，取出分装到20×200mm的试管中，每支试管装20ml培养基，塞上胶塞封上报纸，于121℃条件下灭菌20min；

（2-2）接种：将灭菌后的试管中的培养基趁热倒入平板中，待平板凝固降至室温后开始接种；接种前超净工作台紫外灯消毒20min，于超净工作台中接种；将接种针深入培养至7天的母种斜面试管，刮掉斜面表面的气生菌丝，将靠近试管口没有菌丝覆盖的培养基质切开弃除，选取靠近接种点附近布满菌丝的培养基画井字形，以长宽高各3mm均匀切块，然后放入平板培养基中央，封上密封条，一支试管转接6个平板培养基；

（2-3）培养：将接种好的平板放于17℃下的恒温培养箱静置培养7天左右，即可用于液体三角瓶。

三、接种：

3-1、液体准备：

（3-1-1）配料：每1000ml液体三角瓶培养液所需配料为：白糖20g、豆奶宝3.3g、磷酸二氢钾0.66g、硫酸镁0.66g，称取各种原料进行配料；

（3-1-2）装料：将配好的料装入1000ml的三角瓶中，并充分搅拌溶解，放入一个转子，然后用纯水定容至600ml，且要求PH值在6.2至6.5之间；

（3-1-3）灭菌：将装好料的三角瓶塞上棉塞，并在棉塞外套上锡箔纸，确保锡箔纸完全包裹住棉塞，然后放于高压灭菌锅中，于121℃条件下灭菌60min后取出；

（3-1-4）冷却：将取出的三角瓶在超净台中冷却至18℃至22℃即可准备接种。

3-2、接种培养：

（3-2-1）消毒：将超净台用紫外灯消毒30分钟，且台上的所有工具用酒精和紫外灯消毒后，由专人穿戴专用接种洁净服，戴口罩及医用手套，穿洁净区工作鞋，风淋后进入洁净区，在超净工作台上准备灭菌操作；

（3-2-2）灭菌：将打孔器，接种针所有会深入到平板内的部分通过酒精灯火焰来回灼烧至通红灭菌，然后放置一边冷却；将挑好的平板菌种放入超净台中，并靠近酒精灯火焰附近，撕掉封条，让平板边缘缓缓过火灭菌，切勿烧得过烫；

（3-2-3）打孔取块：将接种针深入平板培养基，刮掉斜面表面的气生菌丝，再用直径10mm的打孔器沿着菌丝蔓延生长的边缘均匀打孔一圈；盖上平板盖备用；

（3-2-4）接种：将冷却后的液体三角瓶瓶口靠近酒精灯火焰，并取下锡箔纸和棉塞，快速用接种针分别从平板培养基内选取4颗菌种，放置过程中接种针不要触碰三角瓶内壁；操作完成后分别将棉塞和锡箔纸在火焰上过火后，再把三角瓶塞紧包好。

四、三角瓶液体培养：

（4-1）重复步骤（3-2-2）、（3-2-3）、（3-2-4）操作直至接种结束，每个平板可转接2至3个三角瓶，然后将三角瓶放入摇床中震荡培养，培养温度为20℃，振幅为250r/min；注意：更换试管时接种针要重新灼烧灭菌，每支母种斜面试管可转接2至3个三角瓶。然后录入菌种批号和接种日期，将三角瓶放入摇床中震荡培养。接种后的液体三角瓶长势良好，菌球颗粒大小均匀，菌丝旺盛，适合进行大规模的生产。

然后，培养至第四天取出三角瓶，将液体菌种打碎20s，然后放回继续培养；培养至第9天取出三角瓶，将液体菌种打碎10min，即可用直接用于生产，也可用于液体转固体或液体转发酵罐的扩繁。

上述液体菌种生产由试管母种到三角瓶，跨过了一级种、二级种直接到三级种的培养过程，具有菌龄短、纯度高、活力强、繁殖快的特点，接种到培养料内有流动性好、萌发点多，发菌迅速等特种点，适合进行大规模的生产。

本文标签： 固体液体金针菇方法