一种用于防治鳞翅目虫害的生防菌剂及其制备工艺

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本发明属于微生物技术领域，公开了一种用于防治鳞翅目虫害的生防菌剂，其包括金龟子绿僵菌、苏云金芽孢杆菌、绿色木霉以及枯草芽孢杆菌。本发明采用的四种菌株的培养液进行配伍，具备较好的协同作用，能够有效杀灭小菜蛾等鳞翅目虫害。

1.一种用于防治鳞翅目虫害的生防菌剂，其包括金龟子绿僵菌、苏云金芽孢杆菌、绿色木霉以及枯草芽孢杆菌。 2.根据权利要求1所述的生防菌剂，其特征在于，所述生防菌剂按照如下工艺制备而得：将金龟子绿僵菌培养液、苏云金芽孢杆菌培养液、绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液按照2-3:1-2:3-5的体积比混合均匀，得到复合液体菌剂；将复合液体菌剂经过冷冻干燥制备成微生物干粉，即得。 3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述金龟子绿僵菌培养液按照如下工艺制备而得：将金龟子绿僵菌种子液按照10%体积比的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养36h，得到金龟子绿僵菌培养液；所述扩大培养基的配方为：葡萄糖20g/L、酵母膏10g、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.1g/L。 4.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述苏云金芽孢杆菌培养液按照如下工艺制备而得：将苏云金芽孢杆菌种子液按照8%体积比的接种量接入到扩大培养基中，30℃培养24h，得到苏云金芽孢杆菌培养液；所述扩大培养基的配方为：玉米淀粉16g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.5g/L和硫酸亚铁0.1g/L。 5.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液按照如下工艺制备而得：将绿色木霉种子液和枯草芽孢杆菌种子液按照1:2的体积比混合，然后按照8%体积比的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养24h，得到绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液；所述扩发培养基的配方为：玉米淀粉20g/L、豆粕8g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙0.2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01mg/L。 6.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述金龟子绿僵菌为ACCC30104，所述苏云金芽孢杆菌为ATCC33679，所述绿色木霉为ATCC26802，所述枯草芽孢杆菌为ATCC6051。 7.按照权利要求1-6所述的生防菌剂在防治鳞翅目虫害中的应用。 8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述鳞翅目虫害为小菜蛾。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种用于防治鳞翅目虫害的生防菌剂及其制备工艺。

背景技术

鳞翅目包括蛾、蝶两类昆虫，属有翅亚纲、全变态类。全世界已知约20万种，中国已知约8000余种。该目为昆虫纲中仅次于鞘翅目的第2个大目。分布范围极广，以热带种类最为丰富。绝大多数种类的幼虫为害各类栽培植物，体形较大者常食尽叶片或钻蛀枝干。体形较小者往往卷叶、缀叶、结鞘、吐丝结网或钻入植物组织取食为害。成虫多以花蜜等作为补充营养，或口器退化不再取食，一般不造成直接危害。

以菜青虫、小菜蛾、夜蛾、螟蛾为代表的鳞翅目害虫是危害蔬菜的主要害虫，尤其威胁十字花科、豆科、茄瓜类、以及旋花科蔬菜的生长和品质。以小菜蛾为例，小菜蛾是一种世界性的十字花科蔬菜主要害虫。长期以来，小菜蛾的防治主要依赖于化学农药。由于不合理使用大量杀虫剂，使小菜蛾对几乎所有90年代以前开发的杀虫剂均产生了较高的抗药性。九十年代以来，国外农药公司开发了几种对小菜蛾有特效的新型杀虫剂，如阿维菌素、锐劲特、有机磷类等，但这些杀虫剂价格昂贵，极大地增加防治成本，且单一地使用这些杀虫剂，也将导致这些杀虫剂产生抗药性。

采用非化学手段防治鳞翅目虫害逐渐成为研究者关注的热点问题，其中微生物拮抗菌等技术在农业生产中己得到应用并取得一定的效果。金龟子绿僵菌是一类能够寄于多种害虫的虫生真菌，能通过体表穿透进入害虫体内，在害虫体内繁殖消耗寄主营养使害虫致死。同时具有不污染环境、无残留、对人畜无害、害虫不会产生抗药性等优点，已经越来越广泛地用于蔬菜害虫生物防治。但是仅仅采用金龟子绿僵菌作为生防菌存在效率低、效果不稳定等缺陷。现有专利技术“CN107114392A”采用金龟子绿僵菌和茚虫威以及其他辅料来制备复合杀虫剂，其提高了杀虫效率，但是仍然使用了茚虫威化学试剂，可能会导致抗药性以及环境污染。为了提高杀虫剂的杀虫效率以及提高环境友好性，现有技术已经开始研究复合生防菌剂。选择复合生防制剂中的菌株较为关键，也是复合生防菌剂研制的难点；如果选择不慎，反而会起到相互拮抗的反作用，降低杀灭能力，并非所有混合菌都具有极高的活性来稳定抑制病害；只有生防菌剂中的微生物能够相互亲和协同才能产生好的生防效果。

发明内容

本发明要提供一种用于防治鳞翅目虫害的生防菌剂，以克服现有技术复合生防制剂存在防治效果不理想、菌株协同性能差等缺陷。

本发明还公开了上述生防菌剂的制备工艺。

为了克服现有技术存在的问题，本发明采用如下技术方案，

一种用于防治鳞翅目虫害的生防菌剂，其包括金龟子绿僵菌、苏云金芽孢杆菌、绿色木霉以及枯草芽孢杆菌。

进一步地，

所述生防菌剂按照如下工艺制备而得：将金龟子绿僵菌培养液、苏云金芽孢杆菌培养液、绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液按照2-3:1-2:3-5的体积比混合均匀，得到复合液体菌剂；将复合液体菌剂经过冷冻干燥制备成微生物干粉，即得。

进一步地，

所述金龟子绿僵菌培养液按照如下工艺制备而得：

将金龟子绿僵菌种子液按照10%体积比的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养36h，得到金龟子绿僵菌培养液；所述扩大培养基的配方为：葡萄糖20g/L、酵母膏10g、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.1g/L。

进一步地，

所述苏云金芽孢杆菌培养液按照如下工艺制备而得：

将苏云金芽孢杆菌种子液按照8%体积比的接种量接入到扩大培养基中，30℃培养24h，得到苏云金芽孢杆菌培养液；所述扩大培养基的配方为：玉米淀粉16g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.5g/L和硫酸亚铁0.1g/L；

进一步地，

所述绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液按照如下工艺制备而得：

将绿色木霉种子液和枯草芽孢杆菌种子液按照1:2的体积比混合，然后按照8%体积比的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养24h，得到绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液；所述扩发培养基的配方为：玉米淀粉20g/L、豆粕8g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙0.2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01mg/L；

优选地，所述金龟子绿僵菌为ACCC30104，所述苏云金芽孢杆菌为ATCC33679，所述绿色木霉为ATCC 26802，所述枯草芽孢杆菌为ATCC6051。

本发明还要求保护上述的生防菌剂在防治鳞翅目虫害中的应用。

优选地，所述鳞翅目虫害为小菜蛾。

本发明还要求保护上述生防菌剂的制备工艺。

需要说明的是，本发明种子培养以及扩大培养方式是本领域常规技术，限于篇幅，并不详述。

本发明所用的耗材均可以从商业途径购买获得。

本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：

与单一菌株相比，混合菌剂具备更稳定更良好的防治效果，但是选择能够协同共生的菌株进行配伍是难题；大多数的菌株无法共生，会产生拮抗；各种生防菌剂之间拮抗作用的增加可能是由对有限资源的竞争造成的，如2种或更多的微生物都要利用共同的资源，这就导致营养供不应求，从而限制竞争群体的数量和活性；本发明从众多菌类中选择四种菌株，其采用不同的杀虫机理，能够协同杀虫，配伍合理，共生协调，互不拮抗，制备工艺也相对简单，应用前景广阔；

金龟子绿僵菌是一类重要的生防真菌，能通过体表穿透进入害虫体内，在害虫体内繁殖消耗寄主营养使害虫致死；还能产生绿僵菌素，为绿僵菌在代谢过程中产生的一种次生代谢产物，对鳞翅目害虫具有触杀作用和拒食作用；

苏云金芽孢杆菌已经应用于制备Bt 杀虫剂，是经培养生产的一种微生物制剂，机理是其释放的有毒的伴孢晶体，能够对杀伤多种害虫，对防止鳞翅目幼虫效果尤为明显；

绿色木霉和枯草芽孢杆菌存在共生关系，培养过程中能够相互促进，产生抗生素等杀虫毒素，还可以杀灭土壤中的病原体，对植物起到多重保护，增加了产量。

说明书附图

图1：25g/L菌悬液对小菜蛾死亡率的影响；

图2：50g/L菌悬液对小菜蛾死亡率的影响；

图3：:100g/L菌悬液对小菜蛾死亡率的影响。

具体实施方式

为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。

实施例1

一种用于防治鳞翅目虫害的生防菌剂，其包括金龟子绿僵菌、苏云金芽孢杆菌、绿色木霉以及枯草芽孢杆菌。

具体按照如下工艺制备而得：

将金龟子绿僵菌种子液（1×108cfu/ml）按照10%体积比的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养36h，得到金龟子绿僵菌培养液；所述扩大培养基的配方为：葡萄糖20g/L、酵母膏10g、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.1g/L；

将苏云金芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）按照8%体积比的接种量接入到扩大培养基中，30℃培养24h，得到苏云金芽孢杆菌培养液；所述扩大培养基的配方为：玉米淀粉16g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.5g/L和硫酸亚铁0.1g/L；

将绿色木霉种子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）按照1:2的体积比混合，然后按照8%体积比的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养24h，得到绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液；所述扩发培养基的配方为：玉米淀粉20g/L、豆粕8g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙0.2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01mg/L；

将金龟子绿僵菌培养液、苏云金芽孢杆菌培养液、绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液按照2:1:3的体积比混合均匀，得到复合液体菌剂；

将复合液体菌剂经过冷冻干燥制备成微生物干粉，即得。

所述金龟子绿僵菌 为 ACCC30104，所述苏云金芽孢杆菌为ATCC33679，所述绿色木霉为ATCC 26802，所述枯草芽孢杆菌为ATCC6051。

实施例2

一种用于防治鳞翅目虫害的生防菌剂，其包括金龟子绿僵菌、苏云金芽孢杆菌、绿色木霉以及枯草芽孢杆菌。

具体按照如下工艺制备而得：

将金龟子绿僵菌种子液（1×108cfu/ml）按照10%体积比的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养36h，得到金龟子绿僵菌培养液；所述扩大培养基的配方为：葡萄糖20g/L、酵母膏10g、硫酸铵5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、磷酸氢二钾0.5g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.1g/L；

将苏云金芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）按照8%体积比的接种量接入到扩大培养基中，30℃培养24h，得到苏云金芽孢杆菌培养液；所述扩大培养基的配方为：玉米淀粉16g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、硝酸钾1.0g/L、硫酸镁0.8g/L、氯化钠0.5g/L和硫酸亚铁0.1g/L；

将绿色木霉种子液（1×108cfu/ml）和枯草芽孢杆菌种子液（1×108cfu/ml）按照1:2的体积比混合，然后按照8%体积比的接种量接入到扩大培养基中，28℃培养24h，得到绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液；所述扩发培养基的配方为：玉米淀粉20g/L、豆粕8g/L、硫酸铵5g/L、磷酸氢二钾2g/L、磷酸二氢钾2g/L、氯化钙0.2g/L、硫酸镁0.1g/L、硫酸亚铁0.01g/L、硫酸锰0.01mg/L；

将金龟子绿僵菌培养液、苏云金芽孢杆菌培养液、绿色木霉-枯草芽孢杆菌混合培养液按照3:2:5的体积比混合均匀，得到复合液体菌剂；

将复合液体菌剂经过冷冻干燥制备成微生物干粉，即得。

所述金龟子绿僵菌为ACCC30104，所述苏云金芽孢杆菌为ATCC33679，所述绿色木霉为ATCC26802，所述枯草芽孢杆菌为ATCC6051。

实施例3

本发明生防菌剂的杀虫活性试验

试验对象：

油菜小菜蛾3龄幼虫；

试验组别：

组1：实施例1；组2：仅采用金龟子绿僵菌，其余同实施例1；组3：仅采用苏云金芽孢杆菌，其余同实施例1；组4：仅采用绿色木霉-枯草芽孢杆菌，其余同实施例1；组5：采用金龟子绿僵菌和苏云金芽孢杆菌，其余同实施例1；组6：空白对照组。

预处理：将微生物干粉分别添加不同重量的水，搅拌均匀，得到浓度为25g/L，50g/L，100g/L的菌悬液；

试验方法：将采自油菜地的小菜蛾经室内饲养，挑选生长一致的3龄幼虫，接于置放油菜菜叶的直径10cm的培养皿，每皿接25头三龄幼虫并作麻醉预处理，喷雾，每次喷一个皿，每皿喷药液2mL，空白对照喷等量清水，其它对照组分别喷洒各自的菌悬液。每个处理组重复3次求平均值。将处理过的培养皿放入25℃，12H/12H光照培养箱内培养，48小时检查死亡和存活的虫数，计算死亡率。试验结果如图1-3所示，图1为采用25g/L菌悬液得实验结果；图2为采用50g/L的菌悬液得实验结果；图3为采用100g/L的菌悬液得实验结果。如图1-3所示，随着菌悬液浓度的增加，各组别对小菜蛾的杀灭率均增加；其中，低浓度的菌悬液中，实施例1组杀灭效果最好，可达到80%左右，明显优于使用单菌剂的组2-3，也明显优于使用两种菌剂的组4-5；高浓度的菌悬液中，实施例1组可达到100％的杀灭率，可见本发明采用的四种菌株的培养液进行配伍，具备较好的协同作用，能够有效杀灭小菜蛾等鳞翅目虫害。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

本文标签： 鳞翅目虫害工艺生防菌剂