活性物质用于防治植物病毒感染的用途

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本发明公开了特定的活性物质单独或组合用于防治植物病毒感染的用途，以及在植物保护和材料保护领域，使用所述特定的活性物质防治所述病毒感染的方法。

1.一种防治植物病毒性疾病的方法，其包含将至少一种式(I)的化合物施用至植物：其中R选自氢、苯硫基和取代的苯基，其中所述苯基被一个或多个独立地选自卤素、羧基和硝基的取代基取代。 2.根据权利要求1的方法，其中R选自氢、苯硫基、2-羧基苯基、4-羧基苯基、3-氯苯基、3，4-二氯苯基、2，5-二氯苯基、3-羧基-4-氯苯基、2-硝基苯基和2-溴-4-硝基苯基。 3.根据权利要求1的方法，其中R为4-羧基苯基。 4.根据权利要求1至3任一项的方法，其中所述防治基于刺激植物抗病毒的天然防御机制。 5.根据权利要求4的方法，其中所述植物抗病毒的天然防御机制为基于RNA沉默的植物防御机制。 6.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述方法为预防性方法。 7.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述植物选自棉花、亚麻、葡萄藤、水果、蔬菜、农作物、花园和林地的观赏植物以及这些植物各自的基因改良品种。 8.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述植物选自茶藨子亚科、胡桃科、桦木科、漆树科、山毛榉科、桑科、木犀科、猕猴桃科、樟科、芭蕉科、茜草科、山茶科、梧桐科、芸香科、茄科、百合科、菊科、伞形科、十字花科、藜科、葫芦科、葱科、蝶形花科、菊科、芸苔科、豆科、蝶形花科、茄科和藜科。 9.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述病毒选自以下科或属：花椰菜病毒科、双生病毒科、雀麦花叶病毒科、长线形病毒科、豇豆花叶病毒科、马铃薯Y病毒科、随伴病毒科、番茄丛矮病毒科、弹状病毒科、布尼亚病毒科、分体病毒科、呼肠孤病毒科、毛发状病毒属、香石竹潜病毒属、豌豆耳突花叶病毒属、真菌传杆状病毒属、大麦病毒属、悬钩子病毒属、黄矮病毒属、玉米雷亚朵非纳病毒属、马铃薯X病毒属、南方菜豆花叶病毒属、纤细病毒属、烟草花叶病毒属、烟草脆裂病毒属、发状病毒属、芜菁黄花叶病毒属和伞形植物病毒属。 10.根据前述权利要求任一项的方法，其中所述病毒选自：芜菁花叶病毒、豆英斑驳病毒、花椰菜花叶病毒、烟草花叶病毒、番茄丛矮病毒、水稻齿叶矮缩病毒、黄瓜花叶病毒、大麦黄矮病毒、甜菜黄化病毒、生菜黄化病毒、玉米花叶病毒、花生矮化病毒和马铃薯Y病毒。 11.根据前述权利要求任一项的方法，其中将所述式(I)的化合物通过喷洒施用至植物。 12.根据前述权利要求任一项的方法，其中将所述式(I)的化合物以0.01至5kg/ha的量施用至植物。 13.如权利要求1、2或3所述的式(I)的化合物用于刺激植物抗病毒的天然防御机制的用途。 14.根据权利要求13的用途，其用于刺激基于RNA沉默的植物防御机制。 15.如权利要求1、2或3所述的式(I)的化合物的用途，其用于在用RNAi构建体转化的基因修饰植物中改善农艺性状和/或提供对病原体、昆虫、害虫的抗性和/或提供胁迫耐受性。 16.式(I)的化合物用作药物：其中R选自氢、苯硫基和取代的苯基，其中所述苯基被一个或多个独立地选自卤素、羧基和硝基的取代基取代。

技术领域

本发明涉及活性物质用于刺激植物抗病毒的天然防御机制以防治植物病毒感染的用途，以及防治植物病毒感染的方法。本发明还涉及活性物质用于激活植物抗病毒的基于RNA干扰的天然防御机制(本文中也命名为基于RNA沉默的天然防御机制)的用途。

背景技术

植物病毒是世界各地主要作物损害的原因。的确，有些病毒家族，如马铃薯Y病毒科，在发达国家和新兴国家都导致严重的产量损失，这与不断增长的粮食需求相冲突。为了限制病毒感染和传播，主要通过预防进行病害治理，因为治疗性方法无效或低效。

已经确定了几种用于设法防治植物病毒的化合物。WO2011/030816教导了某些抗坏血酸衍生物用于防治某些植物病毒的用途。WO2012/016048提供了叠氮化物改性的生物分子作为抗病毒剂，包括抗植物病毒的用途。WO2014/050894教导了其他抗坏血酸的相关化合物用于防治植物病毒的用途。

植物已经进化得可以用它们可利用的资源来持续应对威胁，并在生长或防御生物和非生物威胁之间平衡可利用的资源。RNA沉默在这一平衡中起重要作用，其通过转录基因沉默(TGS)和转录后基因沉默(PTGS)将发育程序和环境应激反应与基因表达变化进行动态连接而起作用。植物的抗病性依赖于预先形成的屏障、有毒次生代谢产物和诱导型防御机制。一经病原体识别，植物通常引发过敏反应，导致感染部位的细胞死亡并防止病原体扩散。此外，病原体检测在远离原发感染部位的植物部位中触发各种诱导型系统防御。这一过程被称为系统获得性抗性(SAR)，在许多植物物种中都是有效的。所获得的抗性对于广泛范围的病原体例如真菌、细菌和病毒的后续感染是长效并且有效的。

甲氧基丙烯酸酯(Strobilurin)类的杀菌剂包含各种各样具有广谱性的合成植物保护化合物。在2002年，通过烟草花叶病毒(TMV)或野火病病原体烟草野火病菌(Pseudomonas syringae pv tabaci)已证实甲氧基丙烯酸酯唑菌胺酯(Pyraclostrobin)增强烟草抗感染的抗性(Herms等人，Plant Physiology 2002，130：120-127)。唑菌胺酯也能够增强无法积累大量的内源性水杨酸的NahG转基因烟草植物的TMV抗性。唑菌胺酯通过在水杨酸(SA)信号机制中作用于SA的下游或通过独立作用于SA而增强烟草的TMV抗性。后一假设更有可能，因为在浸润的叶片中，唑菌胺酯未引起SA诱导的发病机制相关(PR)-1蛋白的积累，所述蛋白通常用作对SA诱导的抗病性的常规分子标记。甲氧基丙烯酸酯类杀菌剂的应用被记载为单独使用(WO 01/82701)或以与代森联的混合物的形式使用(WO 2007/104669)。

在对植物病毒的植物防御反应中，抗病毒RNA沉默途径是影响一系列病毒的局部及系统累积的最广泛的防御体系。RNA沉默是直接使植物宿主细胞防御外源核酸，包括病毒和转座因子的机制。这种防御通过衍生自侵入性核酸的增殖的双链RNA(dsRNA)触发，所述侵入性核酸被宿主处理成尺寸为20-24个核苷酸(nt)的小干扰RNA(siRNAs)。然后，所述siRNAs通过PTGS或TGS分别用于引导病毒或转座因子RNA或DNA的沉默。

然后，RNA沉默是一种有效的抗病毒机制，其中将由病毒双链RNA复制中间体通过Dicer酶处理得到的小干扰siRNAs载入ARGONAUTE效应蛋白，并转回侵入者的RNA基因组，以诱导其退化。这种先天性免疫应答是非常通用的，因为其完全由结构和核苷酸序列基因组特征进行编程，其可以对几乎任何植物病毒作出应答(Shimura等人，2011，Biochimica et Biophysica Acta 1809：601-612)。证实了RNA沉默在植物防御中的重要性，siRNA产生或活性受损的植物对植物病毒是高度敏感的，并且反过来，许多病毒已经进化出RNAi抑制子，以保持毒性(Voinnet O.等人，Nature Review Microbiology 2013Nov；11(11)：745-60)。

总之，尽管在过去已经确定了某些化合物作为某些抗病毒植物防御机制的潜在诱导剂，但仍然需要提供适于刺激植物抗病毒的天然防御机制、特别是刺激植物抗病毒的广泛的非特异性的基于RNA沉默的防御机制，以防治植物的病毒性疾病的活性物质。

定义

本文中使用的术语“卤素”指的是氟、氯、碘或溴原子。

本文中使用的术语“苯硫基”指的是基团-S-苯基。

本文中使用的术语“羧基”指的是基团-COOH。

本文中使用的术语“硝基”指的是基团-NO2。

本文中使用的术语“活性物质”指定为如本文所述的式(I)的化合物或其任意混合物。

附图说明

图1说明了仅使用DMSO或Sortin1处理7天后，SUC-SUL植物的SUL mRNA相对水平的qPCR分析，已标准化为EXP10。误差线表示3次独立实验的标准差。

详细说明

现在已发现，如本文所公开的式(I)的化合物适用于刺激植物抗病毒的天然防御机制，特别是用于刺激植物抗病毒的基于RNA沉默的防御机制。因此，如本文所公开的式(I)的化合物对防治植物的病毒性疾病可以是有用的。本文中使用的术语“防治”(control)或“防治”(controlling)指定为预防性或治疗性防治。

因此，本发明涉及一种用于防治植物的病毒性疾病的方法，更具体地涉及一种用于刺激植物抗病毒的天然防御机制、特别是用于刺激植物抗病毒的基于RNA沉默的防御机制的方法。所述方法包括将一种或多种式(I)的化合物施用至植物：

其中R选自氢、苯硫基和取代的苯基，其中所述苯基被一个或多个独立地选自卤素(优选氯、氟和溴)、羧基和硝基的取代基取代。

在一些实施方案中，所述活性物质为式(I)的化合物，其中R为氢、苯硫基或苯基，所述苯基被一个或两个独立地选自卤素(优选氯、氟和溴)、羧基和硝基的取代基取代。

在一些优选实施方案中，所述活性物质为式(I)的化合物，其中R选自氢、苯硫基、2-羧基苯基、4-羧基苯基、3-氯苯基、3，4-二氯苯基、2，5-二氯苯基、3-羧基-4-氯苯基、2-硝基苯基和2-溴-4-硝基苯基。

在一些更优选的实施方案中，所述活性物质为式(I)的化合物，其中R为4-羧基苯基。所述化合物被称为Sortin 1。

Sortin 1属于刺激酵母分泌的分选抑制剂。已知其在拟南芥(Arabidopsis)悬浮细胞中重定向植物羧肽酶Y(CPY)和其他蛋白质的液泡目的地，并引起这些蛋白质的分泌。整株拟南芥幼苗的类似处理也产生相同的效果，表明该药物在细胞和完整植物中具有相似的作用模式(Zouhar等人，PNAS 2004，101，25：9497-9501)。在拟南芥中，Sortin1对CPY液泡靶向、液泡生物发生和根发育具有可逆效应。Sortin1对影响液泡膜标记物的靶向以及液泡而非内质网、高尔基体或核内体的生物发生具有高度专一性(Hicks等人，Current Opinion in Plant Biology 2010，13：706-713)。

式(I)的某些化合物市售可得。另一些可以通过在以下文献中公开的方法适当地制备：WO2002085894、US20040082578、“Multicomponent one-pot solvent-free synthesis of functionalized unsymmetrical dihydro-1H-indeno[1，2-b]pyridines”：Samai，Chandra Nandi，Kumar，Singh，Tetrahedron Lett.2009，50(50)，7096-7098。

通常将有效量的活性物质施用至植物。施用至植物的有效量的活性物质将取决于不同的因素，如活性物质的性质、制剂、所针对的植物(植物性质和植物部分)、施用方法、处理的目的(预防或治疗)和所针对的病毒。施用至植物的量的范围可以适当地为0.01至5kg/ha，或0.1至3kg/ha，或0.5至2kg/ha。

如上所述，将所述活性物质施用至植物。本文中使用的术语“植物”包括植物及其部分，如植物的地上和/或地下部分以及收获物。地下植物部分包括根、根茎、块茎、吸根、插条(slips)、籽(seeds)和种子(seed)。地上植物部分包括茎(stem)、树皮、芽、叶、花、果、子实体、杆(stalk)、针和枝。因此，所述活性物质可以有效地施用到植物的根、根茎、块茎、吸根、插条、籽、种子、茎、树皮、芽、叶、花、果、子实体、杆、针、枝、收获物上。在可选择的实施方案中，用于防治植物病毒性疾病的方法包括将所公开的活性物质施用到植物的生境和/或储存地。

可以将所述活性物质有效地施用到各种各样的植物上。可以将它施用到市售可得的或使用中的植物品种上。但是，植物品种也理解为意指具有通过传统育种、诱变或借助重组DNA技术培育的新性状的植物，和/或可通过传统育种和优化方法或通过生物技术和基因工程方法或通过这些方法的组合而获得的植物；这包括转基因植物和能够受或不受植物育种者权利(Plant Breeders’Rights)保护的植物。

还可以将所述活性物质有效地施用到转基因生物(GMOs)上。转基因植物为异源基因已被稳定地整合到基因组中的植物。表述“异源基因”本质上意指在植物外提供或组装的基因，并且当将叶绿体或线粒体基因组引入核时，其通过使感兴趣的蛋白质或多肽表达、或使植物中存在的另一基因或植物中存在的其他基因下调或沉默，赋予被转化植物新的或改良的农艺或其他特性(例如，使用反义技术、共抑制技术或RNAi技术[RNA干扰])。位于基因组中的异源基因也称为转基因。转基因因其在植物基因组中的特定位置而被定义，被称为转化事件或转基因事件。

具有赋予这些植物尤其有利的、有用的性状(不论通过育种和/或生物技术获得)的遗传物质的所有植物可以用所公开的方法进行处理。

同样可以根据本发明进行处理的植物和植物品种为能够抵抗一种或多种非生物胁迫因素的那些植物。非生物胁迫条件可以包括，例如，干旱、寒冷和高温条件、渗透胁迫、积涝、土壤含盐量升高、暴露于矿物增加、臭氧条件、高光条件、氮营养物的有限利用率、磷营养物的有限利用率或避荫。

同样可以根据本发明进行处理的植物和植物品种为具有高产量特征的那些植物。这些棕榈植物的高产量的原因可以为，例如，改良的植物生理，改良的植物生长和改良的植物发育，如水利用效率、保水效率、提高的氮利用率、改善的碳同化、改善的光合作用、提高的发芽率和改良的成熟。产量还受改良的株型(plant architecture)影响(在胁迫条件下和非胁迫条件下)，其中提早开花、生产杂交种子的开花控制、幼苗活力、植物大小、节间数和距离、根生长、种子大小、果实大小、荚果大小、荚果数或穗数、每英或穗的种子数量、种子质量、改善的种子填充、减少的种子散播、减少的英开裂和抗倒伏性。其他产量性状包括种子成分，如碳水化合物含量、蛋白质含量、油含量和油成分，营养价值，抗营养化合物的减少，改善的可加工性和改善的可储存性。

同样可以根据本发明进行处理的植物为已经表达出杂种优势或杂交优势特征的杂交植物，其通常导致更高的产量、更高的生命力、更好的健康以及对生物和非生物胁迫因素更好的抗性。这类植物通常通过将雄性不育近交系亲本(母本)与另一雄性可育近交系亲本(父本)进行杂交而产生。通常从雄性不育植物中收获杂交种子并出售给种植者。雄性不育植物有时可以(例如在玉米中)通过去雄获得(即机械地去除雄性繁殖器官或雄花)；但是，更典型地，雄性不育是植物基因组中的遗传决定子决定的。在这种情况下，特别是当种子为从杂交植物收获的所需产物时，确保含有负责雄性不育的遗传决定子的杂交植物的雄性能育性完全恢复通常是有用的。这点可以通过确保父本具有合适的育性恢复基因而实现，所述育性恢复基因能够恢复含有负责雄性不育的遗传决定子的杂交植物的雄性能育性。雄性不育的遗传决定子可以位于细胞质中。细胞质雄性不育性(CMS)的实例已记载于例如芸苔属(Brassica)物种(WO 1992/005251、WO 1995/009910、WO 1998/27806、WO 2005/002324、WO 2006/021972和US 6,229,072)。但是，雄性不育的遗传决定子也可以位于核基因组中。雄性不育植物也可以通过植物生物技术方法如基因工程而获得。在WO 89/10396中记载了产生雄性不育植物的特别有利的手段，其中，例如核糖核酸酶如芽孢杆菌RNA酶在雄蕊的绒毡层细胞中选择性表达。随后通过在绒毡层细胞中表达核糖核酸酶抑制因子如芽孢杆菌RNA酶来恢复能育性(例如WO 1991/002069)。

所述活性物质特别适于防治以下植物的病毒性疾病：棉花，亚麻，葡萄藤，水果，蔬菜，如蔷薇科(Rosaceae sp.)(例如仁果类如苹果和梨子，还有核果类如杏子、樱桃、扁桃和桃子，和软果类如草莓)、茶藨子亚科(Ribesioidae sp.)、胡桃科(Juglandaceae sp.)、桦木科(Betulaceae sp.)、漆树科(Anacardiaceae sp.)、山毛榉科(Fagaceae sp.)、桑科(Moraceae sp.)、木犀科(Oleaceae sp.)、猕猴桃科(Actinidaceae sp.)、樟科(Lauraceae sp.)、芭蕉科(Musaceae sp.)(例如香蕉树和种植园)、茜草科(Rubiaceae sp.)(例如咖啡)、山茶科(Theaceae sp.)、梧桐科(Sterculiceae sp.)、芸香科(Rutaceae sp.)(例如柠檬、橙子和葡萄柚)；茄科(Solanaceae sp.)(例如番茄)、百合科(Liliaceae sp.)、菊科(Asteraceae sp.)(例如生菜)、伞形科(Umbelliferae sp.)、十字花科(Cruciferae sp.)、藜科(Chenopodiaceae sp.)、葫芦科(Cucurbitaceae sp.)(例如黄瓜)、葱科(Alliaceae sp.)(例如韭菜、洋葱)、蝶形花科(Papilionaceae sp.)(例如豌豆)；主要农作物，如禾本科(Gramineae sp.)(例如玉米、草皮、谷物如小麦、黑麦、大米、大麦、燕麦、小米和黑小麦)、菊科(例如向日葵)、芸苔科(Brassicaceae sp.)(例如白菜、紫甘蓝、绿花椰菜、菜花、抱子甘蓝、小白菜、球茎甘蓝、萝卜和油菜、芥菜、山葵和水芹)、豆科(Fabacae sp.)(例如豆、花生)、蝶形花科(例如大豆)、茄科(例如马铃薯)、藜科(例如糖用甜菜、饲料甜菜、瑞士甜菜、甜菜根)；园林和林地的有用植物和观赏植物；以及这些植物各自的基因改良品种。

更具体地，所述活性物质适于防治蔬菜植物的病毒性疾病。

所述活性物质特别适于防治以下科或属的病毒：花椰菜病毒科(Caulimoviridae)、双生病毒科(Geminiviridae)、雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)、长线形病毒科(Closteroviridae)、豇豆花叶病毒科(Comoviridae)、马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、随伴病毒科(Sequiviridae)、番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、弹状病毒科(Rhabdoviridae)、布尼亚病毒科(Bunyaviridae)、分体病毒科(Partitiviridae)、呼肠孤病毒科(Rheoviridae)、毛发状病毒属(Capillovirus)、香石竹潜病毒属(Carlavirus)、豌豆耳突花叶病毒属(Enamovirus)、真菌传杆状病毒属(Furovirus)、大麦病毒属(Hordeivirus)、悬钩子病毒属(Idaeovirus)、黄矮病毒属(Luteovirus)、玉米雷亚朵非纳病毒属(Marafivirus)、马铃薯X病毒属(Potexvirus)、南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)、纤细病毒属(Tenuivirus)、烟草花叶病毒属(Tobamovirus)、烟草脆裂病毒属(Tobravirus)、发状病毒属(Trichovirus)、芜菁黄花叶病毒属(Tymovirus)和伞形植物病毒属(Umbravirus)。

优选地，所述活性物质用于防治以下种的病毒：芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus)、豆英斑驳病毒(bean pod mottle virus)、花椰菜花叶病毒(cauliflower mosaic virus)、烟草花叶病毒(tobacco mosaic virus)、番茄丛矮病毒(tomato bushy stunt virus)、水稻齿叶矮缩病毒(rice ragged stunt virus)、黄瓜花叶病毒(cucumber mosaic virus)、大麦黄矮病毒(barley yellow dwarf virus)、甜菜黄化病毒(beet yellows virus)、生菜黄化病毒(lettuce yellows virus)、玉米花叶病毒(maize mosaic virus)、花生矮化病毒(peanut stunt virus)和马铃薯Y病毒(potato virus Y)。

可以将所述活性物质以任何合适的形式施用至植物。例如，可以将所述活性物质以以下形式施用：悬浮液例如水基或油基悬浮液、乳液、溶液，粉末如可湿性粉末，泡沫，浆，颗粒，微粒，气雾剂或微型胶囊。可以以常规方式制备合适的制剂。包含所述活性物质的制剂可以为即用型组合物，即可以通过适当的装置直接施用至植物的组合物，或它们可以为使用前必须稀释的商品化浓缩物的形式。

所述制剂可以仅包含所述活性物质或包含所述活性物质与其他活性物质的组合，所述其他活性物质如杀虫剂、引诱剂、消毒剂(sterilants)、杀菌剂(bactericides)、杀螨剂、杀线虫剂、其他杀真菌剂、生长调节物质、除草剂、安全剂和/或肥料。

可以将所述活性物质或包含它的制剂以任何常规方式，例如浇水、喷洒、喷粉、喷雾，施用至植物。可以将所述活性物质直接或间接施用到植物、环境、生境和/或储存地。例如，可以将所述活性物质注射到树皮中或树皮下、倾倒或喷洒到植物周围的地上(土壤、沙土、砂砾土、岩土、壤质土或混合土)。另一种类型的施用为喷洒到植物或其植物部分上。可以将所述活性物质组合物以干燥的形式混入地面物质(土壤、沙土、砂砾土、岩土、壤质土或混合土)和/或种子。可以将所述活性物质以干燥的形式或者液体的形式施用到灌溉系统。优选地，将所述活性物质通过喷洒施用至植物。

本发明还涉及如本文所公开的式(I)的化合物用于防治植物病毒性疾病、更具体地用于刺激植物抗病毒的天然防御机制、特别是用于刺激植物抗病毒的基于RNA沉默的防御机制的用途。所述植物和/或病毒如上所公开。

所述式(I)的化合物通过增加小RNA的产生而刺激基于RNA沉默的植物防御机制。有利地，式(I)的化合物增加小RNA产生的能力也可以用在用RNAi构建体转化的转基因植物中，所述转基因植物被设计用于改善农艺性状和/或提供对病原体(例如细菌、真菌)的抗性、对昆虫/害虫和/或胁迫耐受性的抗性。因此，本发明还涉及一种或多种式(I)的化合物在用RNAi构建体转化的转基因植物中通过增加小RNA的产生，而改善农艺性状和/或提供对病原体的抗性、对昆虫/害虫和/或胁迫耐受性的抗性的用途。

如前所述，已知植物利用RNA沉默途径来抵御入侵病毒。在哺乳动物中，直到Y.Li等人和P.V.Maillard等人(Y.Li等人，Science，342：231-234，2013；P.V.Maillard等人，Science，342：235-238，2013)的最近发现，科学家们只能证明RNAi的基因调控作用。现在，Y.Li等人和P.V.Maillard等人已经证明了RNAi在哺乳动物中也可以起抗病毒应答的作用。因此，式(I)的化合物可以用于刺激哺乳动物抗病毒的天然防御机制，特别是用于刺激哺乳动物抗病毒的基于RNA沉默的防御机制。

因此，本发明还涉及如本文所公开的式(I)的化合物用作药物，特别是用于治疗或预防病毒感染。

如本文所公开的式(I)的化合物可以用于治疗或预防哺乳动物病毒感染的方法中，所述方法包括给予有此需要的哺乳动物有效量的如本文所公开的式(I)的化合物。本文中使用的术语“哺乳动物”包括人类。

借助于下面的实施例对本发明进行更详细的解释。

实施例

实施例1：鉴定植物沉默机制的调节剂-使用SUC-SUL报告基因植物

用称为“SUC-SUL拟南芥(Arabidopsis)报告基因植物”的人造报告基因植物可以容易地监测植物的RNA沉默途径(Dunoyer等人，Nat.Genet，37，1356-1360，2005)。

SUC-SUL拟南芥报告基因植物为表达反向重复(IR)双链RNA的转基因植物，所述反向重复(IR)双链RNA设计成在SUC2启动子的控制下，在脉管系统中靶向SULFUR(SUL)转录物(Truernit等人，Planta 196(3)，564-570，1995)。一经表达，dsRNA被处理成指导SULPH转录物的非细胞自主转录后基因沉默的小干扰RNAs，继而导致以叶脉为中心的萎黄病。由于观察到的萎黄病是由SULPHUR转录物的沉默引起的，所以植物上直接可观察到的萎黄扩张与分子水平上RNA沉默途径的强化相关。

发芽5天后，用含有300ppm本发明活性分子的不同溶液、二甲基亚砜(DMSO)5％和标准乳油(EC)预混制剂喷洒拟南芥(A.thaliana)幼苗(每次实验6株幼苗)。对每种分子重复四次。对照植物仅用DMSO处理(模拟处理的植物)。在透射照射下处理14天后，评估所述处理对SUC-SUL报告基因植物的影响，并使用立体显微镜通过测量萎黄区的表面和强度(萎黄百分比)进行数字化的记录。为了评估每种分子的萎黄平均百分比，进行了两个独立的实验。

结果示于下表1。用300ppm的Sortin1及其类似物处理导致了萎黄百分比的显著增加，证实了作为RNA沉默的推定强壮增强子的活性物质的活性。

为了丢弃直接作用于启动子而非RNA沉默机制的分子，然后在第二步，在一些AtSUC2-GFP报告基因植物上，测试了经鉴定具有增加萎黄区表面和强度的能力的活性物质，所述AtSUC2-GFP报告基因植物特别报告SUC2启动子的活性(Wright等人，Plant Physiol.131，1555-1565，2003)。

ID R 平均萎黄％ 1 4-羧基苯基 34.0 2 2-羧基苯基 33.2 3 3，4-二氯苯基 31.0 4 3-羧基-4-氯苯基 29.9 5 2-硝基苯基 26.6 6 SPh 23.1 7 3-氯苯基 21.5 8 2，5-二氯苯基 21.4 9 H 20.6 10 2-溴-4-硝基苯基 19.1

表1：在SUC-SUL报告基因植物上评估Sortin1(化合物ID No.1)及其类似物。模拟处理植物的萎黄程度达到10％。

实施例2：沉默调节剂的分子效应的确认

已经在表现型和分子水平上验证了Sortin1对RNAi机制的增强作用。用200ppm的Sortin1对处于莲座期的四周大的SUC-SUL拟南芥植物进行喷洒。处理7天后，显示出Sortin1诱导了RNAi依赖的以叶脉为中心的萎黄表现型的明显扩张，这在仅DMSO处理(模拟对照)中未观察到。

收集植物地上组织并使用现有技术的方法进行分子分析。萎黄病的可视化扩张与实时qRT-PCR(图1)分析中SUL转录物水平的降低、以及蛋白免疫印迹分析中可定量的SUL蛋白水平的降低相关。此外，这些作用与源自转基因SUL的21-nt和24-nt长siRNA的过度积累有关。总之，这些数据支持Sortin1诱导植物的RNAi途径。

本文标签： 活性病毒感染用途物质植物