粉红单端孢菌及其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应用

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本发明涉及微生物技术领域，本发明所述的内生真菌是从草莓中分离获得，经微生物分类学鉴定，命名粉红单端孢Trichothecium?roseum?TR-1,该菌株已保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国?武汉?武汉大学），保藏号：CCTCC?NO:?M?2015344。本发明最显著的特征是菌株液体发酵液及其乙醚萃取物都对小麦白粉菌有抑制作用，抑制效果达。该发明为Trichothecium?roseum的进一步研制和开发提供优良的出发菌株，是农业上重要的微生物资源。

1.一种粉红单端孢菌TR-1及其发酵产物在防治小麦白粉菌中的应用。 2.根据权利要求1所述的一种粉红单端孢菌TR-1及其发酵产物在防治小麦白粉菌中的应用，其特征在于：TR-1于2015年5月29日包藏于中国典型培养物包藏中心，保藏号为CCTCCNO:M2015344。

技术领域

本发明属于微生物技术领域，涉及一种植物内生真菌在生防领域中的应用，特别涉及植物内生真菌TrichotheciumroseumTR-1或其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应用。

背景技术

粉红单端孢菌(TrichotheciumroseumLinkexFries)属真菌门、半知菌类、丛梗孢目、丛梗孢科、双胞亚科、单端孢菌属。T.roseum与人们的生产、生活关系密切，主要表现在几个方面:(1)该菌可引起多种作物病害，如木瓜果腐病、穗醋栗红粉病、板栗实腐病、香蕉和葡萄红粉病、棉花红粉病、苹果霉心病、套袋鸭梨黑点病、番茄红粉病及玉米粉红聚端孢穗腐病等；(2)该菌产生的次级代谢产物—粉红单端孢毒素，可导致食品毒素污染；(3)T.roseum作为植物病害的生防因子也备受人们关注，目前已报道其发酵液在玉米小斑病、小麦赤霉病、小麦纹枯病、烟草赤星病、西瓜枯萎病油菜菌核病和棉花黄萎病都具有一定抑菌效果；因此，对T.roseum生防特征的深入了解，有助于人们对其致害性的科学防控及其有益特性的充分利用。目前关于该菌对小麦白粉病菌的活性国内外鲜有报道。

发明内容

本发明人从草莓中分离的一株内生真菌TrichotheciumroseumLinkexFries，并发现其具有拮抗小麦白粉病菌的生物活性。因此，本发明的目的在于提供内生真菌Trichotheciumroseum及其发酵产物在防治小麦白粉病菌中的应用。

为了实现本发明的目的，发明人从草莓根茎部中分离到一株内生真菌TR-1，并对其进行了分类鉴定，将菌株代号命名为TR-1，于2015年5月29日保藏在中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉珞珈山武汉大学），保藏号：CCTCCNO:M2015344，TR-1鉴定为TrichotheciumroseumTR-1。

另外，本发明人对所分离的内生真菌TR-1做了进一步的形态学、同源性、培养方法和生物活性等方面的特征进行了研究，具体结果如下：

1、内生真菌TR-1的形态特征

（1）菌落形态：TR-1在马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（potatodextroseagar，PDA）上25℃培养4d后在光学显微镜下观察照片，在PDA培养基上菌丝的菌落中央为粉红色且边缘呈白色绒毛状。其菌落形态特征见图1。

（2）孢子形态：分生孢子长圆形或洋梨形，双细胞，无色，孢基具偏乳头突起，分生孢子大小长18.0～19.2μm(平均18.5μm)，宽8.4～9.6μm(平均9.0μm)；孢子多点出芽其有性形态特征见图2。

2、粉红单端孢TR-1菌株滤液的制备

在250mL的三角瓶中加入150mL的PDB液体培养基，经高压灭菌后接入粉红单端孢病菌菌丝5块（直径约为5cm），在25℃恒温摇床震荡黑暗培养15d。用纱布过滤培养液，除去菌丝及孢子，取过滤液过0.22μm细菌滤膜，滤液即为粉红单端孢备用滤液。

3、不同稀释倍数的TR-1菌株滤液对小麦白粉菌的活性

采用离体叶段法，将培养至1叶1心的小麦，第1叶剪成30mm长叶段，置于含50ug/ml苯骈咪唑的0.5%的水琼脂平板上，每皿（直径60mm）摆放8片叶段。加入表面活性剂吐温20（终浓度为2.5×10-4）与发酵液充分混匀，在喷雾塔中施用，喷雾量4ml。设置6个处理，分别为TR-1菌株滤液4ml，3ml，2ml，1ml，0.5ml和0ml，剩余的用无菌水补足4ml。同时喷施含2.5×10-4吐温20的PDB溶液处理为阴性对照，喷施清水为空白对照，自然晾干，24h后接种小麦白粉病菌分生孢子（接种量为15个分生孢子/10倍视野）。然后放在17±1℃的空调房中培养，先避光12h，然后在24小时40W日光灯照射下（培养室）培养，结果见图3。

4、内生真菌发酵液萃取物对小麦白粉菌活性测定

内生真菌TR-1液体发酵培养7天，得总发酵液，经离心或过滤得菌丝和菌液部分，用乙醚萃取，浓缩成浸膏，得到乙醚提取物。准确称取TR-1菌株发酵液的乙醚提取物0.01g，并加入10mL无菌水，超声波震荡充分溶解，最终配置成浓度为1000mg/L的母液。采用离体叶段法，将母液配置成10mg/L的工作液，用Poter喷雾塔均匀喷施到小麦离体叶段上，自然晾干，24小时后接种新鲜的小麦白粉病菌，另设阴性对照组（乙醚处理）和空白对照组（纯水处理），置于17℃培养室进行培养。7天后调查发病情况，结果见图4。

本发明的优点：本发明从草莓中分离到一株内生真菌TrichotheciumroseumTR-1，并发现其对小麦白粉菌具有较高的拮抗活性，从而可将内生真菌TR-1作为生防菌应用于小麦白粉菌引起的植物疾病的防治中。另外，由于内生真菌TR-1发酵液的乙醚萃取物具有更高的生防活性，因此可以继续利用该植物内生真菌资源获得天然生物活性物质，为其开发和应用以及探讨内生真菌的生理生态功能提供依据。

附图说明

图1为TrichotheciumroseumTR-1的菌落形态特征。

图2为TrichotheciumroseumTR-1的孢子形态特征。

图3为TrichotheciumroseumTR-1的发酵滤液对小麦白粉菌的活性测定结果，从上向下依次为TR-1菌株滤液的4ml，3ml，2ml，1ml，0.5ml和0ml处理。

图4为TrichotheciumroseumTR-1的发酵液萃取物对小麦白粉菌活性测定结果。从左到右依次为乙醚萃取相，乙酸乙酯萃取相，阴性CK。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做进一步作描述，但是本发明的保护范围并不限于这些实施例。凡是不背离本发明构思的改变或等同替代均包括在本发明的保护范围之内。

实施例1：本发明所述粉红单端孢TR-1的分离及鉴定

将采集新鲜植物的各部分组织在流水下冲洗，除去表面附着的泥沙，放入4℃冰箱保存。内生真菌的分离采用常规组织分离法，样品先用无菌水清洗2次，将样品切成1～2cm长小段放入75%酒精中浸泡1～2min（根据分离部位确定时间长短），用无菌水冲洗2～3次.再用1.5%有效氯含量的次氯酸钠消毒7～10min，用无菌水冲洗3次，将表面消毒的组织在灭菌的培养皿中用灭菌的刀片切成0.2cm×0.2cm的片段，用灭菌滤纸将消毒组织块表面的水分充分吸干。最后将组织块移植到PDA培养基(含50U/mL硫酸链霉素和氨苄青霉素)平板上，置25℃恒温培养箱中避光培养。每隔1天进行观察，及时挑取切口处长出的新鲜菌丝，转接到新的PDA平板培养进行编号保存。采用离体叶段法测定菌株其对小麦白粉菌抑制作用，选择活性的菌株，命名为菌株TR-1。结合常规的形态学鉴定和分子鉴定将其鉴定为粉红单端孢。

实施例2：本发明所述的TR-1菌株不同滤液对小麦白粉菌的活性

采用离体叶段法，将培养至1叶1心的小麦，第1叶剪成30mm长叶段，置于含50ug/ml苯骈咪唑的0.5%的水琼脂平板上，每皿（直径60mm）摆放8片叶段。加入表面活性剂吐温20（终浓度为2.5×10-4）与发酵液充分混匀，在喷雾塔中施用，喷雾量4ml。设置6个处理，分别为TR-1菌株滤液4ml，3ml，2ml，1ml，0.5ml和0ml，剩余的用无菌水补足4ml。同时喷施含2.5×10-4吐温20的PDB溶液处理为阴性对照，喷施清水为空白对照，自然晾干，24h后接种小麦白粉病菌分生孢子（接种量为15个分生孢子/10倍视野）。然后放在17±1℃的空调房中培养，先避光12h，然后在24小时40W日光灯照射下（培养室）培养。结果见表1。

表1粉红单端孢TR-1无菌滤液对小麦白粉菌的活性

实施例3：本发明所述的TR-1菌株发酵液萃取物对小麦白粉菌活性测定

发酵终止后过滤发酵产物，滤液于11000r/min离心10min，取上清液，将有活性发酵液进行冷冻干燥，获得干粉依次用乙醚和乙酸乙酯等体积萃取，萃取5次，每次10min。将有机相收集，旋蒸浓缩成浸膏备用。水相回收。取LPS-1菌株发酵产物萃取物，将其配成10mg/L,进行活性测定。采用离体叶段法，喷雾量为350mL/m2，自然晾干，24小时后接种新鲜的小麦白粉病菌，另设溶剂处理为阴性对照和空白对照。置于17℃培养室进行培养。7天后调查发病情况。

TR-1菌株发酵液萃取物对小麦白粉菌活性

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本文标签： 白粉病菌小麦产物粉红