一种抑制南美白对虾虾体黑变的生物保鲜剂

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本发明涉及一种抑制南美白对虾虾体黑变的生物保鲜剂，所述生物保鲜剂是以分离纯化的南美白对虾体内的酪氨酸氧化酶为抗原免疫蛋鸡，从蛋黄中分离提取酪氨酸氧化酶特异性卵黄抗体制备得到。本发明的生物保鲜剂能显著抑制酪氨酸氧化酶的活性，有效控制南美白对虾的虾体黑变。同时，本发明的生物保鲜剂来源天然，安全、无潜在危害，特异、高效，使用简单。

1.一种抑制南美白对虾虾体黑变的生物保鲜剂，其特征在于所述生物保鲜剂是通过以下步骤制备得到：（1）选取新鲜南美白对虾，以磷酸盐缓冲液浸泡研磨后虾体，提取酪氨酸氧化酶粗酶液，依次经过丙酮沉淀，凝胶层析和离子交换层析三步纯化，制备得到电泳纯级的南美白对虾酪氨酸氧化酶；（2）以纯化得到的酪氨酸氧化酶为抗原，与弗氏佐剂充分混合乳化，皮下散点注射免疫产蛋母鸡诱导抗体产生；（3）收集免疫后鸡蛋，分离卵黄和蛋清，合并卵黄液，利用水提取法分离卵黄中的水溶性组分；（4）硫酸铵两步盐析法纯化水溶性组分中的特异性卵黄抗体，最终得到抑制南美白对虾虾体黑变的生物保鲜剂。 2.根据权利要求1所述的生物保鲜剂，其特征在于所述免疫蛋鸡的方法为总共免疫四次，每次间隔14天。

技术领域

本发明涉及一种生物保鲜剂，具体涉及一种抑制南美白对虾虾体黑变的生物保鲜剂。

背景技术

南美白对虾体内含有的高活性酪氨酸氧化酶，在虾收获死亡后，可催化酪氨酸形成醌类化合物，并经氧化反应形成黑色素沉积在虾体表面导致虾体黑变，严重影响南美白对虾的感官品质和商品价值。研究表明，通过抑制酪氨酸氧化酶的活性可有效降低南美白对虾发生黑变的几率，延长其货架期。

目前对酪氨酸氧化酶活性的抑制方法主要是利用亚硫酸盐类、4-己基间苯二酚、植酸等化学保鲜剂。这些保鲜剂的添加虽然能够发挥较好的黑变抑制效果，却产生了非常严重的潜在食品安全危害。

发明内容

针对传统化学保鲜剂存在的问题，本发明的目的在于提供一种天然、安全、特异、高效的生物保鲜剂，可以有效抑制南美白对虾的虾体黑变。

本发明以分离纯化的南美白对虾体内的酪氨酸氧化酶为抗原免疫蛋鸡，蛋鸡在酪氨酸氧化酶的刺激下诱发一系列的免疫应答反应，激发免疫系统B细胞分化成浆细胞，分泌大量针对酪氨酸氧化酶的特异性抗体进入血液。蛋鸡在产蛋过程中，血液中的特异性抗体在卵巢IgG受体的介导下进入卵巢滤泡和输卵管，经卵黄膜转移至卵黄形成卵黄抗体，将这些针对酪氨酸氧化酶特异性卵黄抗体从蛋黄中分离提取出来即可作为生物保鲜剂；该生物保鲜剂能显著抑制酪氨酸氧化酶的活性，有效控制南美白对虾的虾体黑变。

本发明的抑制南美白对虾虾体黑变的生物保鲜剂是通过以下步骤制备得到：

（1）选取新鲜南美白对虾，以磷酸盐缓冲液浸泡研磨后虾体，提取酪氨酸氧化酶粗酶液，依次经过丙酮沉淀，凝胶层析和离子交换层析三步纯化，制备得到电泳纯级的南美白对虾酪氨酸氧化酶；

（2）以纯化得到的酪氨酸氧化酶为抗原，与弗氏佐剂充分混合乳化，皮下散点注射免疫产蛋母鸡诱导抗体产生；

（3）收集免疫后鸡蛋，分离卵黄和蛋清，合并卵黄液，利用水提取法分离卵黄中的水溶性组分；

（4）硫酸铵两步盐析法纯化水溶性组分中的特异性卵黄抗体，最终得到抑制南美白对虾虾体黑变的生物保鲜剂。

与传统化学保鲜剂相比较，本发明的主要优点在于：（1）卵黄抗体通过与酪氨酸氧化酶的专一结合发挥作用，特异性强，效率更高；（2）卵黄抗体由鸡蛋这类天然食品提取制备，安全，无潜在危害。

附图说明

图1是0℃下卵黄抗体抑制酪氨酸氧化酶活性效果图。

图2是37℃下卵黄抗体抑制酪氨酸氧化酶活性效果图。

图3是4 ℃下存放72 h南美白对虾保鲜效果图。

具体实施方式

下面结合附图并通过具体实施例来详细说明本发明。

实施例1：南美白对虾酪氨酸氧化酶特异性卵黄抗体的制备及抑制黑变效应

1、酪氨酸氧化酶粗酶液的提取

称取100 g新鲜南美白对虾，清洗干净，均匀剪碎后冰浴中研磨成糊状，加入2.5倍提前预冷至4 ℃的pH7.4 0.01 M的磷酸盐缓冲液，轻微匀浆（10000 rpm，0.5 min）提取，4 ℃下10000 rpm离心15 min，上清液即为粗酶液。

2、酪氨酸氧化酶的逐级纯化

2.1丙酮沉淀法纯化粗酶

取200 mL粗酶液，按体积比1:2加入预冷至-10 ~ -15 ℃的丙酮，搅拌均匀，静置20 min，4 ℃条件下10000 r/min离心15 min，上清液再次按体积比1:1加入预冷至-10 ~ -15 ℃的丙酮，搅拌均匀，静置20 min，4 ℃条件下10000  r/min离心15 min，将沉淀溶解于100 mL pH7.4 0.01 M的磷酸盐缓冲液中，置于4 ℃冰箱中过夜。次日4 ℃条件下再次10000  r/min离心15 min，上清即为纯化酶液。

2.2 Sephadex G-100 凝胶层析

Sephadex G-100凝胶柱（1.6x50 cm）采用0.01 M pH7.4磷酸盐缓冲液平衡完全后，将丙酮沉淀所得粗酶液浓度调节至10 mg/mL，取5mL上柱，以 0.01 M pH7.4磷酸盐缓冲液洗脱，洗脱速度1 mL/min，50管分步收集，4 min/管，检测波长为280 nm。取0.4mL洗脱液，加入0.2 mL 0.5 M的L-脯氨酸、0.2 mL 5 M邻苯二酚和2.2 mL pH7.4 0.01 M的磷酸盐缓冲液，混合均匀并开始计时，在530 nm下测定其吸光值，以酶反应的初速度表示酶活力，收集具有酶活力的组分，备用。

2.3 DEAE Sephadex A-50阴离子交换层析

DEAE Sephadex A-50阴离子交换层析柱（1.6×50 cm）采用0.01 M pH7.4磷酸盐缓冲液平衡完全后，将Sephadex G-100层析纯化所得高活性酶液浓度调整至10 mg/mL，取3mL上柱，用含有0 - 1 M KCl的0.01 M pH7.4 磷酸盐缓冲液溶液梯度洗脱，洗脱速度1 mL/min，50管分管收集，3 min/管，检测波长为280 nm。按2.2所述方法测定各管洗脱液酪氨酸氧化酶的活性，收集具有酶活力组分即为纯化后的酪氨酸氧化酶，冷冻干燥备用。

3、产蛋母鸡的免疫

选取12只产蛋期的健康莱亨蛋鸡随机分为两组，每组六只，分别作为对照组和实验组。取纯化制得的酪氨酸氧化酶干粉10 mg，溶于4 mL生理盐水中，与弗氏完全佐剂按1:1混合后充分乳化，于实验组蛋鸡的颈部、双翅及胸肌处皮下散点注射（1 mL/只），首次免疫后第15，29，43天更换弗氏不完全佐剂以相同浓度分别加强免疫一次，按每周为一个计量周期收集免疫后的鸡蛋，4 ℃储存备用。对照组蛋鸡以生理盐水同步免疫。

4、特异性卵黄抗体的提取纯化

采用硫酸铵两步盐析法提取特异性卵黄抗体，具体操作步骤如下：

（1）制备水溶性组分：收集一个计量周期所产鸡蛋，清洗干净后分离蛋清和卵黄，合并卵黄液，按体积比1:10加入双蒸水稀释，混合均匀后用0.1 mol/L的HCl调节pH至5.1±0.1，4 ℃静置过夜。4 ℃条件下4000 r/min离心20 min，取上清液过滤，收集滤液。

（2）向滤液中加入50%饱和度的硫酸铵，4 ℃下搅拌反应40 min并静置2 h, 使蛋白沉淀。4 ℃条件下4000 r/min离心20 min，弃去上清。

（3）将沉淀溶解于适量的0.01 M pH7.4磷酸盐缓冲液中，再加入33%饱和度的硫酸铵进行二次盐析，4 ℃下搅拌反应20 min并静置40 min使蛋白沉淀。4 ℃条件下10000 r/min离心15 min，弃去上清。

（4）收集沉淀并溶解于适量的0.01 M pH7.4磷酸盐缓冲液中，并在0.01 M pH7.4磷酸盐缓冲液中透析，每12小时更换一次透析液，透析48小时后冷冻干燥，得到卵黄抗体干粉备用。

5、特异性卵黄抗体抑制酪氨酸氧化酶活性效果分析

将制备所得特异性卵黄抗体用0.067 M pH 7.2磷酸缓冲液溶解稀释成浓度分别为0.1 mg/mL，0.5 mg/mL，1 mg/mL，5 mg/mL的溶液，置于0 ℃冰浴和 37 ℃恒温水浴孵育10 min，分别取0.2 mL加入到3.8 mL 0.1 μg/mL的酪氨酸氧化酶溶液中，以磷酸缓冲液和5 mg/mL的阴性卵黄抗体溶液分别作为空白和阴性对照，按2.2所述方法分别测定酪氨酸氧化酶的活性，分析酶活性随作用时间的变化情况。

结果表明，无论在0 ℃（图1）还是在 37 ℃（图2），当反应体系中特异性卵黄抗体浓度达到0.5mg/mL时，即可对酪氨酸氧化酶的活性产生显著抑制效应，且该抑制效应与特异性卵黄抗体的浓度呈线性关系，抗体浓度越高，抑制效应越显著，当特异性抗体浓度达到5mg/mL时，酪氨酸氧化酶的活性可降低80%以上。随着作用时间的延长，低浓度抗体对酪氨酸氧化酶活性的抑制效应稍有减弱，但高浓度抗体的抑制作用仍然保持高效。

6、特异性卵黄抗体抑制南美白对虾黑变效果评价

取鲜活南美白对虾，低温致死后将虾体用无菌生理盐水冲洗3遍，于5mg/mL特异性卵黄抗体溶液中浸泡20 min，取出沥干，置于4 ℃下保藏，同时以无菌生理盐水浸泡处理的虾体作为空白对照，观察虾体发生黑变时间的变化，评价特异性卵黄抗体抑制黑变的效果。

由图3可以看出，新鲜南美白对虾经5 mg/mL特异性卵黄抗体浸泡处理20 min后，在4 ℃条件下存放72小时，虾体依然没有发生黑变，而未经处理的虾体却在第24小时就已经发生黑变，表明特异性卵黄抗体能够显著推迟虾体的黑变时间，是一种潜在的高效生物保鲜剂。

本文标签： 南美抑制生物保鲜剂白对虾