一种玉米小斑病田间自然诱发技术以及该技术的应用

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本发明涉及农作物病害研究技术领域，具体涉及一种玉米小斑病田间自然诱发技术以及该技术的应用，该技术的大致步骤为：地膜覆盖、双行单株种植3‑4叶1心玉米苗，行间距0.4‑0.5m，在田间玉米植株7‑8叶期，用温棚人工接种的新鲜玉米小斑病病株作为田间诱发菌源，横放在玉米植株中间的墒面上，结合田间正常浇灌，保持土壤湿润，本发明以感染人工接种的玉米小斑病病菌的病株作为诱发菌源，操作简便，诱发菌源容易获得；诱发菌源与野生玉米小斑病菌种群结构相似，致病能力可靠；本发明能够提供良好的、稳定的病原菌条件；本发明提供的技术不仅适用于玉米种质对小斑病的抗性筛选，也适用于筛选防治病害的药剂以及技术研究。

1.一种玉米小斑病田间自然诱发技术，其特征在于：它包括以下步骤：a.玉米小斑病病原菌的分离；b.玉米小斑病病菌的活化；c.玉米小斑病病菌孢子悬浮液配制:玉米小斑病病菌活化好后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，并用接种针将菌块移至PDA培养基表面，25-28℃黑暗培养7-10d后，获得分生孢子；在PDA培养基表面注入清水，并刮洗PDA培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为1-10×10个/mL；d.玉米苗人工喷雾接种:在温棚中种植玉米感病品种，待玉米苗长至5-7叶，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每株玉米植株喷孢子悬浮液15-25mL，喷雾接种后的玉米植株用塑料薄膜覆盖保湿处理24-48h，发病环境温度22-32℃，接种7d后，玉米叶片布满病斑，病株连根拔起，作为田间诱发菌源；e.田间玉米小斑病自然诱发：玉米感病品种育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植3-4叶1心玉米苗，行间距0.4-0.5m，在田间玉米植株7-8叶期，将步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，4-6株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间情况正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润。 2.根据权利要求1所述的玉米小斑病田间自然诱发技术，其特征在于：步骤a中玉米小斑病病原菌的分离方法为：采集具有典型症状的玉米小斑病病叶标样，用剪刀将玉米叶片剪成单病斑叶片，用灭菌镊子将剪好的叶片放入浓度为75％的乙醇中浸25-30s，再转入0.1％的升汞溶液中处理2-3min，用无菌水冲洗3-5遍，用无菌镊子将叶片，转入PDA培养皿中，每皿内放4片叶片，于25-28℃培养4-6d后，挑取病斑叶片边缘菌丝到新的PDA培养皿中，于25-28℃培养4-6d，经单孢分离法纯化后，将单菌落转入PDA培养基斜面上培养5-7d，4℃保存备用。 3.根据权利要求1所述的玉米小斑病田间自然诱发技术，其特征在于：步骤b中玉米小斑病菌的活化方法为：将步骤a所得的玉米小斑病菌转入PDA培养基中，于25-28℃培养7-10d。 4.根据权利要求1所述的玉米小斑病田间自然诱发技术，其特征在于：所述的玉米感病品种为粤甜22、上品、红玉2号以及农科玉368中的一种。 5.根据权利要求1-4任意一项所述的玉米小斑病田间自然诱发技术的应用：其特征在于：在玉米种质对玉米小斑病的抗病性鉴定研究中的应用。 6.根据权利要求1-4任意一项所述的玉米小斑病田间自然诱发技术的应用：其特征在于：在筛选防治玉米小斑病的药剂以及研究防治玉米小斑病药剂的施药方法中的应用。

技术领域

本发明涉及农作物病害研究技术领域，具体涉及一种玉米小斑病田间自然诱发技术以及该技术的应用。

背景技术

玉米小斑病(Southern corn leaf blight)是一种世界性的玉米重要病害，主要危害叶片，也危害叶鞘、苞叶、果穗和籽粒。玉米小斑病在玉米整个生育期均可发病，以抽雄前后为病害发生高峰期。病叶由植株下部向上部扩展，发病严重时，叶片布满病斑，影响植株光合作用，导致叶片提早枯死而减产，一般可引起感病品种减产10％以上，严重发生年份减产20％～80％，甚至毁种绝收。该病害具有发生普遍，蔓延扩展速度快等特点。近年来，随着鲜食玉米种植产业化的发展、玉米品种的更新和栽培制度的变革，玉米小斑病在我国玉米主产区发生日益严重，严重制约了我国玉米产业的安全生产。

玉米小斑病菌[Bipolaris maydis(Nisikado et Miyake)Shoemake]是一种侵染能力和致病能力较强的病菌，病菌分生孢子在适宜条件下萌发4-8h，即可产生芽管并侵入玉米叶片的表皮细胞，接种24h后能引起叶肉细胞的快速死亡，3-4d内即可形成病斑，之后病斑产生分生孢子，借助雨水气流传播，对田间生长的玉米进行重复侵染。玉米生长中后期田间降水多，湿度高，容易造成小斑病的流行，过于密植地、连作田发病较重。

利用玉米品种的抗耐性是防治玉米小斑病最为经济的方法，而化学杀菌剂的使用则是防治玉米小斑病最为有效的方法。在玉米品种抗耐性和杀菌剂药效筛选田间试验中，往往需要良好的稳定的发病条件，才能真实反应试验结果的准确性，而田间初始诱发菌源的数量与病害的发生有着密切的关系，其也是玉米连作田病重的主要原因。目前在玉米品种抗小斑病筛选试验中，主要采用田间自然发病法和辅助人工接种法(即将人工培养的病菌孢子直接喷雾接种到玉米植株的每一叶片上，或是将前一年收集的病叶粉碎，在玉米心叶期施于心叶中或撒施到被试验的玉米行间)。采用田间自然发病法，试验成功性及其结果的稳定性受田间初始菌源的影响较大，同一区域不同地块发病程度不尽相同，通常前季有玉米小斑病发生的连作田病重。以病菌孢子作为接种体进行玉米植株喷雾接种，需要叶片保湿处理，才能满足孢子萌发侵染条件，由此又极易使所有喷过病菌的叶片发病过重，植株后期长势差，体现不出抗耐品种抵抗病害垂直向上扩展的能力，有可能导致一些原本具有耐病性种质表现感病，失去应有的利用价值。以前一年收集病叶粉碎作为接种体施于心叶中或撒施到被试验的玉米行间理论上可行，但受到前一年病叶发病程度、存放条件及病叶孢子数量、孢子活力等诸多因素的影响，无法保证每批次诱发菌源的一致性及其致病能力的可靠性，而将人工接种的玉米小斑病新鲜病株作为田间玉米小斑病初始诱发菌源，可以解决这一问题。但是，如果将新鲜病株荫干后存放半个月以上，病叶病斑上的孢子数量和孢子活力均明显下降。因此，田间玉米小斑病诱发菌源的选择及其利用方式将直接影响病害的发生发展效果，目前尚无利用人工接种的新鲜病株作为玉米小斑病田间诱发菌源的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作可行、高效适用的玉米小斑病田间自然诱发技术及以及该技术的应用，该技术可满足玉米种质的抗病性筛选和病害防治研究所需的发病条件。

本发明的目的通过如下技术方案实现：一种玉米小斑病田间自然诱发技术，它包括以下步骤：

a.玉米小斑病病原菌的分离；

b.玉米小斑病病菌的活化:

c.玉米小斑病病菌孢子悬浮液配制:玉米小斑病菌活化好后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，并用接种针将菌块移至PDA培养基表面，25-28℃黑暗培养7-10d后，获得分生孢子；在PDA培养基表面注入清水，并刮洗PDA培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为1-10×105个/mL；

d.玉米苗人工喷雾接种:在温棚中种植玉米感病品种，待玉米苗长至5-7叶，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每株玉米植株喷孢子悬浮液15-25mL，喷雾接种后的玉米植株用塑料薄膜覆盖保湿处理24-48h，发病环境温度22-32℃，接种7d后，玉米叶片布满病斑，病株连根拔起，作为田间诱发菌源；

e.田间玉米小斑病自然诱发：玉米感病品种育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植3-4叶1心玉米苗，行间距0.4-0.5m，在田间玉米植株7-8叶期，将步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，4-6株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间情况正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润。

本发明所述的玉米小斑病由玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)引起。

其中，步骤a中玉米小斑病病原菌的分离方法为：采集具有典型症状的玉米小斑病病叶标样，用剪刀将玉米叶片剪成单病斑叶片，用灭菌镊子将剪好的叶片放入浓度为75％的乙醇中浸25-30s，再转入0.1％的升汞溶液中处理2-3min，用无菌水冲洗3-5遍，用无菌镊子将叶片，转入PDA培养皿中，每皿内放4片叶片，于25-28℃培养，4-6d后挑取边缘菌丝到新的PDA培养皿中，于25-28℃培养4-6d，经单孢分离法纯化后，将单菌落转入PDA培养基斜面上培养5-7d，4℃保存备用。

步骤b中玉米小斑病菌的活化方法为：将步骤a所得的玉米小斑病菌转入PDA培养基中，于25-28℃培养7-10d。

所述的玉米感病品种为粤甜22、上品、红玉2号以及农科玉368中的一种。

所述的玉米小斑病田间自然诱发技术的应用：在玉米种质对玉米小斑病的抗病性鉴定研究中的应用。玉米小斑病田间自然诱发技术在玉米种质对玉米小斑病的抗病性鉴定研究中的应用的具体方法为：不同玉米种质育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植3-4叶1心玉米苗，行间距0.4-0.5m，在田间玉米植株7-8叶期，将所述步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，4-6株横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润，在玉米乳熟期调查各种质的发病情况。

所述的玉米小斑病田间自然诱发技术的应用：在筛选防治玉米小斑病的药剂以及研究防治玉米小斑病药剂的施药方法中的应用。玉米小斑病田间自然诱发技术在筛选防治玉米小斑病的药剂以及研究防治玉米小斑病药剂的施药方法中的应用的具体方法为：试验的玉米感病品种育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植3-4叶1心玉米苗，行间距0.4-0.5m，在田间玉米植株7-8叶期，将所述步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，4-6株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润，分别于施病株5d(8-9叶期，病叶率达20％)和15d后(抽雄期，病叶率达60％)进行玉米小斑病的药剂防治，在玉米乳熟期调查药剂各处理的发病情况。

较之现有技术而言，本发明的优点在于：a.本发明以感染人工接种的玉米小斑病病菌的病株作为诱发菌源，操作简便，诱发菌源容易获得；b.诱发菌源与野生玉米小斑病菌种群结构相似，致病能力可靠；c.较田间自然发病法而言，本发明技术能够提供良好的、稳定的病原菌条件；d.较人工喷雾接种法而言，本发明技术能充分体现出抗耐品种抵抗病害垂直向上扩展的能力，从而有效区分出品种的抗病性；本发明提供的技术不仅适用于玉米种质对小斑病的抗性筛选，也适用于筛选防治病害的药剂以及技术研究，因此本发明具有科学合理、操作简单、方便实用的优点。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明内容进行详细说明：

实施例一：一种玉米小斑病田间自然诱发技术，包括以下步骤：

a.玉米小斑病病原菌的分离；

b.玉米小斑病菌的活化；

c.玉米小斑病病菌孢子悬浮液配制:玉米小斑病菌活化好后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，并用接种针将菌块移至PDA培养基表面，28℃黑暗培养7d后，获得分生孢子；在PDA培养基表面注入清水，并刮洗PDA培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为1×105个/mL；

d.玉米苗人工喷雾接种:在温棚中种植玉米感病品种上品，待玉米苗长至6叶，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每株玉米植株喷孢子悬浮液20mL，喷雾接种后的玉米植株用塑料薄膜覆盖保湿处理24h，发病环境温度25℃，接种7d后，玉米叶片布满病斑，病株连根拔起，作为田间诱发菌源；

e.田间玉米小斑病自然诱发：试验玉米感病品种粤甜22育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植4叶1心玉米苗，行间距0.45m，在田间玉米植株7叶期，将步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，分别取4株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间情况正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润。

其中，步骤a中玉米小斑病病原菌的分离方法为：采集具有典型症状的玉米小斑病病叶标样，用剪刀将玉米叶片剪成单病斑叶片，用灭菌镊子将剪好的叶片放入浓度为75％的乙醇中浸30s，再转入0.1％的升汞溶液中处理2min，用无菌水冲洗3遍，用无菌镊子将叶片，转入PDA培养皿中，每皿内放4片叶片，于28℃培养，5d后挑取边缘菌丝到新的PDA培养皿中，于28℃培养5d，经单孢分离法纯化后，将单菌落转入PDA培养基斜面上培养7d，4℃保存备用。

步骤b中玉米小斑病菌的活化方法为：将步骤a所得的玉米小斑病菌转入PDA培养基中，于28℃培养7d。

实施例二：一种玉米小斑病田间自然诱发技术，包括以下步骤：

a.玉米小斑病病原菌的分离；

b.玉米小斑病菌的活化；

c.玉米小斑病病菌孢子悬浮液配制:玉米小斑病菌活化好后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，并用接种针将菌块移至PDA培养基表面，28℃黑暗培养7d后，获得分生孢子；在PDA培养基表面注入清水，并刮洗PDA培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为1×105个/mL；

d.玉米苗人工喷雾接种:在温棚中种植玉米感病品种上品，待玉米苗长至6叶，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每株玉米植株喷孢子悬浮液20mL，喷雾接种后的玉米植株用塑料薄膜覆盖保湿处理24h，发病环境温度25℃，接种7d后，玉米叶片布满病斑，病株连根拔起，作为田间诱发菌源；

e.田间玉米小斑病自然诱发：试验玉米感病品种粤甜22育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植4叶1心玉米苗，行间距0.45m，在田间玉米植株7叶期，将步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，分别取2株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间情况正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润。

其中，步骤a中玉米小斑病病原菌的分离方法为：采集具有典型症状的玉米小斑病病叶标样，用剪刀将玉米叶片剪成单病斑叶片，用灭菌镊子将剪好的叶片放入浓度为75％的乙醇中浸30s，再转入0.1％的升汞溶液中处理2min，用无菌水冲洗3遍，用无菌镊子将叶片，转入PDA培养皿中，每皿内放4片叶片，于28℃培养，5d后挑取边缘菌丝到新的PDA培养皿中，于28℃培养5d，经单孢分离法纯化后，将单菌落转入PDA培养基斜面上培养7d，4℃保存备用。

步骤b中玉米小斑病菌的活化方法为：将步骤a所得的玉米小斑病菌转入PDA培养基中，于28℃培养7d。

实施例三：一种玉米小斑病田间自然诱发技术，包括以下步骤：

a.玉米小斑病病原菌的分离；

b.玉米小斑病菌的活化；

c.玉米小斑病病菌孢子悬浮液配制:玉米小斑病菌活化好后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，并用接种针将菌块移至PDA培养基表面，28℃黑暗培养7d后，获得分生孢子；在PDA培养基表面注入清水，并刮洗PDA培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为1×105个/mL；

d.玉米苗人工喷雾接种:在温棚中种植玉米感病品种上品，待玉米苗长至6叶，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每株玉米植株喷孢子悬浮液20mL，喷雾接种后的玉米植株用塑料薄膜覆盖保湿处理24h，发病环境温度25℃，接种7d后，玉米叶片布满病斑，病株连根拔起，作为田间诱发菌源；

e.田间玉米小斑病自然诱发：试验玉米感病品种粤甜22育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植4叶1心玉米苗，行间距0.45m，在田间玉米植株7叶期，将步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，分别取6株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间情况正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润。

其中，步骤a中玉米小斑病病原菌的分离方法为：采集具有典型症状的玉米小斑病病叶标样，用剪刀将玉米叶片剪成单病斑叶片，用灭菌镊子将剪好的叶片放入浓度为75％的乙醇中浸30s，再转入0.1％的升汞溶液中处理2min，用无菌水冲洗3遍，用无菌镊子将叶片，转入PDA培养皿中，每皿内放4片叶片，于28℃培养，5d后挑取边缘菌丝到新的PDA培养皿中，于28℃培养5d，经单孢分离法纯化后，将单菌落转入PDA培养基斜面上培养7d，4℃保存备用。

步骤b中玉米小斑病菌的活化方法为：将步骤a所得的玉米小斑病菌转入PDA培养基中，于28℃培养7d。

将实施例一、实施例二、实施例三的发病效果进行对比可知：玉米小斑病田间自然诱发技术能提高田间玉米小斑病的自然发病效果，当田间施放的病株达4株和6株时，5d后(玉米8叶期)的玉米病叶率均达20％，而施放的病株为2株时，5d后的玉米植株仅见零星病斑，病叶率约5％。平铺横放在玉米植株中间墒面上的玉米小斑病病株越多，自然发病的效果也会更好，但基于工作量考虑，以及避免植株前期生长发病过重，明显影响植株后期生长的现象，因此选择在玉米植株中间墒面上平铺横放的玉米小斑病病株4-6株较为适宜。

实施例四：一种玉米小斑病田间自然诱发技术，包括以下步骤：

a.玉米小斑病病原菌的分离；

b.玉米小斑病菌的活化；

c.玉米小斑病病菌孢子悬浮液配制:玉米小斑病菌活化好后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，并用接种针将菌块移至PDA培养基表面，25℃黑暗培养10d后，获得分生孢子；在PDA培养基表面注入清水，并刮洗PDA培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为5×105个/mL；

d.玉米苗人工喷雾接种:在温棚中种植玉米感病品种红玉2号，待玉米苗长至5叶，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每株玉米植株喷孢子悬浮液15mL，喷雾接种后的玉米植株用塑料薄膜覆盖保湿处理48h，发病环境温度22℃，接种7d后，玉米叶片布满病斑，病株连根拔起，作为田间诱发菌源；

e.田间玉米小斑病自然诱发：试验玉米感病品种上品育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植3叶1心玉米苗，行间距0.4m，在田间玉米植株8叶期，将步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，5株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间情况正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润。

其中，步骤a中玉米小斑病病原菌的分离方法为：采集具有典型症状的玉米小斑病病叶标样，用剪刀将玉米叶片剪成单病斑叶片，用灭菌镊子将剪好的叶片放入浓度为75％的乙醇中浸25s，再转入0.1％的升汞溶液中处理2min，用无菌水冲洗5遍，用无菌镊子将叶片，转入PDA培养皿中，每皿内放4片叶片，于25℃培养，6d后挑取边缘菌丝到新的PDA培养皿中，于25℃培养4d，经单孢分离法纯化后，将单菌落转入PDA培养基斜面上培养6d，4℃保存备用。

步骤b中玉米小斑病菌的活化方法为：将步骤a所得的玉米小斑病菌转入PDA培养基中，于25℃培养8d。

实施例五：一种玉米小斑病田间自然诱发技术，包括以下步骤：

a.玉米小斑病病原菌的分离；

b.玉米小斑病菌的活化；

c.玉米小斑病病菌孢子悬浮液配制:玉米小斑病菌活化好后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，并用接种针将菌块移至PDA培养基表面，27℃黑暗培养7d后，获得分生孢子；在PDA培养基表面注入清水，并刮洗PDA培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为10×105个/mL；

d.玉米苗人工喷雾接种:在温棚中种植玉米感病品种农科玉368，待玉米苗长至7叶，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每株玉米植株喷孢子悬浮液25mL，喷雾接种后的玉米植株用塑料薄膜覆盖保湿处理36h，发病环境温度32℃，接种7d后，玉米叶片布满病斑，病株连根拔起，作为田间诱发菌源；

e.田间玉米小斑病自然诱发：试验玉米感病品种农科玉368育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植4叶1心玉米苗，行间距0.5m，在田间玉米植株8叶期，将步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，5株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间情况正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润。

其中，步骤a中玉米小斑病病原菌的分离方法为：采集具有典型症状的玉米小斑病病叶标样，用剪刀将玉米叶片剪成单病斑叶片，用灭菌镊子将剪好的叶片放入浓度为75％的乙醇中浸28s，再转入0.1％的升汞溶液中处理3min，用无菌水冲洗4遍，用无菌镊子将叶片，转入PDA培养皿中，每皿内放4片叶片，于27℃培养，4d后挑取边缘菌丝到新的PDA培养皿中，于27℃培养6d，经单孢分离法纯化后，将单菌落转入PDA培养基斜面上培养5d，4℃保存备用。

步骤b中玉米小斑病菌的活化方法为：将步骤a所得的玉米小斑病菌转入PDA培养基中，于27℃培养10d。

实施例六：本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术与田间自然发病法、植株孢子喷雾接种法的诱发效果对比试验

在进行实施例六的诱发效果对比试验时，发明人选用的玉米小斑病田间自然诱发技术为实施例一所述的玉米小斑病田间自然诱发技术，具体诱发效果对比试验方法如下：

a.玉米小斑病病原菌的分离：步骤a中玉米小斑病病原菌的分离方法为：采集具有典型症状的玉米小斑病病叶标样，用剪刀将玉米叶片剪成单病斑叶片，用灭菌镊子将剪好的叶片放入浓度为75％的酒精中浸30s，再转入0.1％的升汞溶液中处理2min，用无菌水冲洗3遍，用无菌镊子将叶片，转入PDA培养皿中，每皿内放4片叶片，于28℃培养，5d后挑取边缘菌丝到新的PDA培养皿中，于28℃培养5d，经单孢分离法纯化后，将单菌落转入PDA培养基斜面上培养6d，4℃保存备用。

b.玉米小斑病菌的活化：步骤b中玉米小斑病菌的活化方法为：将步骤a所得的玉米小斑病菌转入PDA培养基中，于28℃培养7d。

c.玉米小斑病病菌孢子悬浮液配制:玉米小斑病菌活化好后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，并用接种针将菌块移至PDA培养基表面，28℃黑暗培养7d后，获得分生孢子；在PDA培养基表面注入清水，并刮洗PDA培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为1×105个/mL；

d.玉米苗人工喷雾接种:在温棚中种植玉米感病品种粤甜22，待玉米苗长至6叶，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每株玉米植株喷孢子悬浮液20mL，喷雾接种后的玉米植株用塑料薄膜覆盖保湿处理24h，发病环境温度25℃，接种7d后，玉米叶片布满病斑，病株连根拔起，作为田间诱发菌源；

e.田间玉米种植：试验玉米感病品种粤甜22育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植4叶1心玉米苗，行间距0.45m，每处理种8株苗，3组重复，整体试验分3个田块进行，3个田块进行分别进行植株孢子喷雾接种、本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术以及自然发病，其中自然发病的试验田块选自上一年有玉米小斑病发生的连作田，植株孢子喷雾接种、本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术以及自然发病的试验田相隔50m以上。植株密度约为3500株/亩，田间正常管理。

f.田间玉米小斑病自然诱发：在田间玉米植株7叶期和抽雄初期，分别将步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，4株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间正常浇灌，使保持土壤湿润，其余管理同大田。

田间玉米植株小斑病菌喷雾接种：在田间玉米植株抽雄初期，约11-13叶期，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每玉米植株喷孢子悬浮液约50mL，接种后的玉米植株分两组，一组用塑料薄膜覆盖保湿处理24h，另一组未用塑料薄膜覆盖保湿处理，其余肥水管理同田间玉米小斑病自然诱发，即结合田间正常浇灌，使保持土壤湿润，其余管理同大田。

g.在乳熟期调查各处理玉米植株穗上三叶及穗下所有叶片的发病情况，计算病情指数。

病叶分级标准参照[中华人民共和国农业行业标准NY/T 1248 2-2006《玉米抗病虫性鉴定技术规范第2部分：玉米抗小斑病鉴定技术规范]

0级，叶片上无病斑；

1级，叶片上病斑占叶面积少于或等于5％；

3级，叶片上病斑占叶面积6％-10％；

5级，叶片上病斑占叶面积11％-30％；

7级，叶片上病斑占叶面积31％-70％；

9级，叶片枯死。

试验结果(见表1):

与自然发病对照组相比，采用本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术，能明显提高田间玉米小斑病的自然发病效果，且发病效果稳定，其中以玉米植株7-8叶期诱发，发病效果明显好于抽雄初期的诱发效果。而采用病菌孢子喷雾接种法，需要覆盖薄膜保湿处理才能引起较好的发病效果，但该方法处理由于田间植株较为高大，薄膜保湿处理操作较为困难，如未采用薄膜保湿处理，易受接种当天或第二天环境气候的影响，无法保证每批次发病效果的稳定性。另外，用植株孢子喷雾接种法，同时结合薄膜保湿处理，易使喷有病菌的叶片发病过重，植株后期长势差，体现不出抗耐品种抵抗病害垂直向上扩展的能力，有可能导致一些原本具有耐病性种质表现感病，失去应有的利用价值。

采用本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术，病叶由植株下部向上部扩展，病情发展趋势同自然发病法，其中以植株基部叶片病情最重(有9、7、5级)，中部叶片病情其次(5、3、1级)，上部叶片病情最轻(3、1、0级)。采用病菌孢子喷雾接种法，植株病叶的病级较为相近，其原因与植株各部位叶片受菌一致有关。

表1不同试验方法对玉米小斑病的诱发效果比较

*其中，所述的病株诱发为本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术，在病株诱发和孢子喷雾接种处理的3个试验田块中，其接种时间均间隔1d。

同列中数值后不同小写字母表示差异显著(P＝0.05)；不同大写字母表示差异极显著(P＝0.01)。

实施例七：玉米小斑病田间自然诱发技术在玉米种质对玉米小斑病的抗病性鉴定研究中的应用

1.材料与方法：本试验所选的供试玉米品种有上品、粤甜22，榕甜1号、永珍7号，玉米品种种植随机排列，在玉米7-8叶期，采用对上品、粤甜22，榕甜1号、永珍7号这4种不同的玉米种质进行玉米小斑病的田间自然诱发，具体方法如下：

a.玉米小斑病病原菌的分离：采集具有典型症状的玉米小斑病病叶标样，用剪刀将玉米叶片剪成单病斑叶片，用灭菌镊子将剪好的叶片放入浓度为75％的乙醇中浸30s，再转入0.1％的升汞溶液中处理2min，用无菌水冲洗3遍，用无菌镊子将叶片，转入PDA培养皿中，每皿内放4片叶片，于28℃培养，5d后挑取边缘菌丝到新的PDA培养皿中，于28℃培养5d，经单孢分离法纯化后，将单菌落转入PDA培养基斜面上培养7d，4℃保存备用。

b.玉米小斑病菌的活化：将步骤a所得的玉米小斑病菌转入PDA培养基中，于28℃培养7d。

c.玉米小斑病病菌孢子悬浮液配制:玉米小斑病菌活化好后，用直径为5mm的打孔器在菌落边缘切取菌块，并用接种针将菌块移至PDA培养基表面，28℃黑暗培养7d后，获得分生孢子；在PDA培养基表面注入清水，并刮洗PDA培养基表面的孢子，过滤后用清水稀释孢子悬浮液，使分生孢子终浓度约为1×105个/mL；

d.玉米苗人工喷雾接种:在温棚中种植玉米感病品种上品，待玉米苗长至6叶，喷施玉米小斑病病菌孢子悬浮液，每株玉米植株喷孢子悬浮液20mL，喷雾接种后的玉米植株用塑料薄膜覆盖保湿处理24h，发病环境温度25℃，接种7d后，玉米叶片布满病斑，病株连根拔起，作为田间诱发菌源；

e.田间玉米小斑病自然诱发：试验玉米感病品种粤甜22育苗移栽，地膜覆盖、双行单株种植4叶1心玉米苗，行间距0.45m，在田间玉米植株7-8叶期，将步骤d连根拔起的玉米小斑病病株，分别取4株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，之后结合田间情况正常管理，正常浇灌，保持土壤湿润。

接着，重复步骤a-d，分别对上品、榕甜1号、永珍7号这另外3种不同的玉米种质进行玉米小斑病的田间自然诱发，在玉米乳熟期调查各玉米种质的发病情况。

为了验证本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术在玉米种质对玉米小斑病的抗病性鉴定应用中的优越性，发明人还进行了田间自然发病作为对比，试验结果见表2：

结果与分析：

供试的玉米品种在不同试验条件下，具有不同的发病效果。采用本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术，能明显提高植株的发病效果，供试的4个玉米品种病情差别明显，品种间抗感趋势与表2中田间自然发病2(发病较好)的效果一致，均以榕甜1号、永珍7号抗性好于上品、粤甜22。表明采用本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术，能反应品种间的抗性差别，而在田间自然发病较差的田块中，供试的4个玉米品种病情指数均低，无法对参试品种的抗性进行合理筛选和评价。

表2不同试验条件下不同玉米品种小斑病的病情调查

实施例八：玉米小斑病田间自然诱发技术在筛选防治玉米小斑病的药剂以及研究防治玉米小斑病药剂的施药方法中的应用

a.材料与方法

供试玉米品种有玉米感病品种粤甜22，在玉米7-8叶期，采用本发明的诱发法进行玉米小斑病的田间自然诱发(即粤甜22育苗移栽，地膜覆盖双行单株种植4叶1心玉米苗，行间距0.45m，在田间玉米植株7-8叶期，取温棚人工接种的新鲜玉米小斑病病株4株平铺横放在玉米植株中间的墒面上，结合田间正常浇灌，使土壤保持湿润)，同时在施病株5d后(8-9叶期，病叶率达20％)和15d后(抽雄初期，病叶率达60％)进行玉米小斑病的药剂防治，供试药剂有30％的混配药BY，30％爱苗EC，其使用浓度、用药次数和用药时期参见表3，每株喷药量约30mL(8-9叶期)和50mL(抽雄初期)。在玉米乳熟期调查药剂各处理的发病情况，试验结果见表3。其中所述的混配药BY为以丙环唑和异菌脲为活性成分的药剂，在专利CN 105638713A中已经公开。

b.结果与分析

采用本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术，能明显提高玉米植株的发病效果，在相同的使用条件下，供试的混配药BY防治效果明显好于爱苗，其中混配药BY药剂用药2次的防效好于用药1次的防效，而在玉米8-9叶发病初期用药1次的防治效果略好于玉米抽雄初期病叶率达60％的防效。采用本发明的玉米小斑病田间自然诱发技术，可为药剂筛选和药剂使用技术研究提供良好的、稳定的试验条件。

表3药剂不同种类及不同施药时期对玉米小斑病的防治效果比较

本文标签： 技术田间玉米自然小斑病